抗豬隱孢子蟲(Cryptosporidium suis)單克隆抗體的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、本研究對鄭州某豬場分離的豬源隱孢子蟲(Cryptosporidium)進行鑒定以確定種類和基因型。將分離株卵囊經(jīng)仔豬傳代和純化后，制備免疫抗原，經(jīng)細胞融合建立了抗豬源隱孢子蟲單克隆抗體雜交瘤細胞株，并對制備的單克隆抗體進行生物學特性研究，建立了由單抗介導的間接免疫熒光檢測方法。
　　 用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法對鄭州某豬場的隱孢子蟲分離株進行了形態(tài)學檢查和卵囊大小測定，卵囊在飽和蔗糖溶液中呈粉紅色，卵囊壁光滑無色薄而均

2、勻；經(jīng)改良抗酸染色后，卵囊呈玫瑰紅色，輪廓呈球形或橢圓形。卵囊大小為4.48～5.0μm×4.02～4.48μm，平均為4.74μm×4.25μm，卵囊形狀指數(shù)（長/寬）為1～1.10。用巢式PCR擴增該分離株18S rRNA基因部分片段，并進行PCR產(chǎn)物測序，所測序列用Blast在核酸序列數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，利用Clustal X1.81進行序列比對修正，結(jié)果顯示該序列與豬隱孢子蟲（C.suis）參考序列同源率100％。該分離株感染

3、7日齡仔豬，表現(xiàn)輕度腹瀉，卵囊在仔豬體內(nèi)潛伏期為3～4d，排卵囊高峰期在感染后7～21d，持續(xù)時間在35d。根據(jù)以上鑒定結(jié)果確定該豬源隱孢子史分離株為豬隱孢子蟲（C.suis）。
　　 用飽和蔗糖溶液漂浮法收集豬隱孢子蟲卵囊，然后用蔗糖梯度離心法進行卵囊純化。將得到的純凈卵囊反復凍融和超聲波處理制備抗原，免疫BALB/c小鼠。在PEG1000作用下，將隱孢子蟲抗體陽性的免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合；經(jīng)間接ELISA法陽

4、性篩選，3次有限稀釋法克?。猾@得3株能穩(wěn)定分泌抗豬隱孢子蟲McAbs的雜交瘤細胞株，分別命名為1E1C5、1E11A5、2B7A1。用間接ELISA疊加試驗、間接免疫熒光試驗鑒定單抗的反應(yīng)性。結(jié)果顯示三株單抗分別屬于IgM、IgG3和IgG2a類；其細胞培養(yǎng)上清效價分別為1：3200、1：1600和1：3200，小鼠腹水效價分別為1：1.6×105、1：1.6×105和1：0.8×105;ELISA疊加試驗表明3株單抗可識別兩個不同抗原

5、位點，1E1C5有較高的親和力；免疫熒光試驗結(jié)果顯示3株單抗均針對豬隱孢子蟲卵囊壁抗原決定簇，能與豬隱孢子蟲卵囊壁反應(yīng)，但與艾美耳球蟲（Eimeria）、人隱孢子蟲(C.hominis)有微弱的交叉反應(yīng)。本試驗獲得了3株可識別豬隱孢子蟲卵囊壁的單克隆抗體，為進一步開展豬隱孢子蟲快速診斷研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 本試驗用已建立的抗豬隱孢子蟲單克隆抗體1E1C5為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG為二抗建立了檢測豬隱孢子蟲的間接免疫熒光

6、檢測方法。單抗的稀釋液用1%BSA，最佳稀釋度為1：400，最佳作用時間為60min。二抗的最佳稀釋度為1：400，最佳作用時間為45min。該方法不與環(huán)孢子蟲(Cyclospora)、C.andersoni、Cparvum、C.baileyi卵囊和賈第蟲(Giardia)包囊發(fā)生交叉反應(yīng)，僅與雞艾美耳球蟲和C.hominis卵囊發(fā)生較弱的交叉反應(yīng)，對豬隱孢子蟲卵囊的檢測閾值為250個·mL-1。用該方法和改良抗酸染色法同時對50份豬糞