抗hBLyS 多、單克隆抗體的研制及應(yīng)用.pdf

1、人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBLyS)是1999年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族新成員，它與某些免疫疾病的制病機(jī)制密切相關(guān)，其低量或過量表達(dá)均能引起機(jī)體的免疫失衡。該研究以大腸桿菌BL21(λDE3)表達(dá)重組hBLyS的可溶性蛋白為抗原，分別免疫日本大耳白兔和BALB/c小鼠，制備出抗hBLyS的多克隆和單克隆抗體，并對(duì)這兩種抗體的一些特性進(jìn)行鑒定。此外，應(yīng)用這兩種抗體建立hBLyS的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。 1.抗hBLyS多克隆抗

2、體的制備與鑒定選取2～3kg的雄性日本大耳白兔，淋巴結(jié)注射弗氏佐劑乳化的可溶性hBLyS蛋白，每間隔2周注射一次；第3次免疫后11天，耳動(dòng)脈采血，間接ELISA檢測(cè)抗血清的效價(jià)為50萬倍；頸總動(dòng)脈放血，制備抗血清，并應(yīng)用分級(jí)飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化，westen-blot分析抗體的特異性。 2.抗hBLyS單克隆抗體的制備與特性鑒定用hBLyS蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，通過5次亞克隆獲

3、得1株分泌抗hBLyS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，，染色體數(shù)目在87～101之間；該抗體屬于IgG1類蛋白，其腹水效價(jià)可達(dá)2×106，通過western-blot鑒定其特異性良好。采用小鼠腹腔注射法大量制備抗體，A蛋白親和層析法純化抗體。 3.建立檢測(cè)hBLyS蛋白含量的ELISA方法選用2種ELISA方案對(duì)hBLyS蛋白含量的測(cè)定方法進(jìn)行研究，方案一用鏈霉親和素做間接包被，方案二用生物素-親和素系統(tǒng)做終反應(yīng)放大；優(yōu)化選擇2種檢測(cè)方