應(yīng)用ICSI-Tr和受精卵胞質(zhì)注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛胚胎的初步研究.pdf

1、為建立一套簡便、有效的轉(zhuǎn)基因水牛制作技術(shù)方法,本研究對水牛顯微受精介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因和受精卵胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因的相關(guān)影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　 1.探討了應(yīng)用ICSI-Tr(intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis)技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛胚胎的可行性。以p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP為載體,比較了精子的不同處理方式(NaOH和凍融)、NaOH處理精子

2、不同時(shí)間(5min、10min、20min、30min和60min)以及不同外源DNA濃度(5ng/μL、10ng/μL、25ng/μL和50ng/μL)對ICSI-Tr轉(zhuǎn)基因效率的影響。結(jié)果顯示:NaOH處理組的囊胚EGFP表達(dá)率46.1％,與凍融精子處理組(47.1％)差異不顯著,但發(fā)育率顯著高于凍融處理精子組(28.3％vs16.7％,P＜0.05)。處理60 min和30min組的分裂率為78.9％和77.5％,顯著高于20mi

3、n、10min和5min組的64.0％、60.0％和64.0％(P＜0.05),其中30min處理組的囊胚EGFP表達(dá)率高達(dá)44.4％,顯著高于其他處理組(P＜0.05)。25ng/μL組和50ng/μL組的早期胚胎EGFP表達(dá)效率差異不顯著(41.3％vs42.5％),但顯著高于5ng/μL和10ng/μL組(22.5％和35.5％),25ng/μL組的囊胚EGFP表達(dá)效率顯著高于其他組(P＜0.05)。
　　 2.探討了受精

4、卵胞質(zhì)內(nèi)注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛胚胎的可行性。通過比較了受精后注射外源DNA的時(shí)間(6h、7-8h、9-10h、11-12h、13-16h和18-20h)、外源DNA的濃度(10ng/μL、25ng/μL、50ng/μL和70ng/μL)和DNA不同的線性和環(huán)狀比例(4:1、3:1、2:1、1:1、0:1和1:0)的轉(zhuǎn)基因效率發(fā)現(xiàn),7-8h和9-10h注射組的囊胚EGFP表達(dá)率分別為50.0％和42.9％,顯著高于其他組(P＜0.05)。50

5、ng/μL和70ng/μL組的囊胚EGFP表達(dá)率為50.0％和66.7％,顯著高于其他處理組(P＜0.05),隨著DNA濃度的升高,囊胚期的EGFP表達(dá)效率呈逐漸升高趨勢,但囊胚率逐漸降低,適宜的注射濃度為50ng/μL。外源DINA線性環(huán)狀比4:1和1:0組的囊胚EGFP表達(dá)率為50.0％和40.0％,顯著的高于其他比例組(P＜0.05)。
　　 上述結(jié)果表明:應(yīng)用ICSI-Tr技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛胚胎,NaOH處理精子適宜的時(shí)