水牛乳腺基因表達譜與生長激素轉基因水牛的初步研究.pdf

1、水牛是中國南方極具開發(fā)潛力的主要家畜，具有耐粗飼、乳品品質好等優(yōu)點。但由于我國本地水牛產奶性能低下，致使奶水牛產業(yè)的發(fā)展緩慢。因此，如何應用現(xiàn)代生物技術培育出高產奶量的水牛新品種是目前要解決的主要問題。本研究首先分析了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織基因表達譜，尋找差異表達基因，研究水牛的泌乳機制，并為培育高產奶量的轉基因水牛提供豐富的候選基因素材;然后，探索轉座子系統(tǒng)在水牛轉基因中的應用，以期提高水牛轉基因的效率;構建了乳腺特異性生長激素

2、基因(GH)轉基因表達載體，在乳腺細胞和乳腺組織中進行檢測，分析外源GH基因的表達對乳蛋白等基因表達的影響;最后，采用隨機整合、轉座子主動整合等轉基因技術將重組GH基因導入水?；蚪M，生產GH轉基因的水牛胚胎，以期培育出高產奶量轉基因水牛新品種。本研究取得的主要結果總結如下:
　　 1.水牛泌乳期與非泌乳期基因表達譜及差異表達分析。構建水牛泌乳期和非泌乳期乳腺組織基因表達譜，分析差異表達和泌乳期高豐度表達的基因，探討水牛泌乳的分

3、子機制，也為轉基因水牛提供外源基因乳腺泌乳期特異性表達啟動子?；虮磉_譜序列拼接后獲得114，014個單一的Unigenes，與牛的基因組信息比對注釋了30290個基因，可以定位到270條相應的通路上(pathway)，其中與乳脂肪、乳蛋白和乳糖合成代謝通路相關基因表達豐度較高。在泌乳期乳腺組織中特異性表達的基因有3053個，占到所有基因序列的2.68％。比較水牛乳腺兩個時期基因表達量，泌乳期表達量上調的基因有1390個，下調的基因有5

4、851個。在270條KEGG通路中有228個通路涉及到差異表達基因，如介導生長激素作用的JAK-STAT和MAPK信號通路。實時定量PCR(QRT-PCR)檢測到水牛的非泌乳期乳腺組織中有少量的乳蛋白基因表達。κ酪蛋白(CN3)基因表達量在非泌乳期與泌乳期乳腺中都是顯著高于其它基因。與非泌乳期相比，泌乳期乳腺CN1S1基因表達量增加了6958倍，CN1S2增加了4800倍，κCN和αLA增加了1000倍左右，而β酪蛋白增加了244倍，與

5、測序結果基本一致。泌乳期和非泌乳期的乳腺組織中檢測到GHR, PRLR和IGF1R的表達，說明GH、PRL和IGF1可能參與了泌乳的分子調控過程。
　　 2.水牛乳腺上皮細胞(BME)基因表達分析。通過PB轉座子攜帶的LT抗原永生化誘導水牛乳腺上皮細胞(BME)，建立檢測乳腺轉基因表達載體的細胞模型。PB轉座子為骨架的永生化載體pXL-BACII-bCN2/LT轉染后的BME細胞的腺泡消失速度和成纖維樣轉變降低。在添加催乳素誘導

6、培養(yǎng)后，第30代的永生化處理的BME細胞能檢測到乳蛋白基因的表達。其中CN1S1基因表達量為非泌乳期乳腺的88.32倍，CN3為32.09倍，CN1S2和αLA基因表達量分別為2.8倍和3.3倍。結果表明，初步建立了細胞水平檢測乳腺特異性表達載體的體外模型。
　　 3.水牛轉座子轉基因技術方法的建立。本研究通過構建piggyBac(PB)，passport(PP)和sleeping beauty(SB)轉座子轉基因載體，轉染水牛

7、胎兒成纖維細胞(BFF)，同時對轉座子轉基因系統(tǒng)進行優(yōu)化，以期建立水牛轉座子轉基因技術體系。轉座子轉基因載體轉染水牛的胎兒成纖維細胞(BFF)后，均能觀察到標記基因EGFP的表達。應用p18T載體、PB、PP和SB轉座子表達NEO基因，轉染細胞后篩選獲得的G418抗性細胞克隆形成數(shù)(CFN)差異不顯著。與隨機整合相比，加入相應的轉座酶后，PB轉座子系統(tǒng)抗性細胞克隆數(shù)量提高了22倍，PP轉座子系統(tǒng)提高了8倍，SB轉座子提高了14倍，PB轉

8、座子系統(tǒng)獲得了最高的轉基因效率。PB轉座子在轉座子和轉座酶比例(Tn∶Ts)為1∶1的時候轉基因效率最高，而PP和SB轉座子為1∶0.5。當添加的轉座酶質粒過量時，PB轉座子的轉基因效率下降幅度沒有PP和SB轉座子大。通過QRT-PCR檢測了不同轉座子外源基因的整合拷貝數(shù)，結果顯示:隨機整合組每個單倍體基因組整合拷貝數(shù)從5個拷貝至51.9個拷貝不等。PB轉座子為16.62拷貝，PP轉座子為2.5拷貝。SB轉座子整合到基因組中的轉基因拷貝

9、數(shù)最多，單倍體基因組中為98個拷貝。以上結果顯示:三種轉座子均能應用于水牛的轉基因研究，轉基因效率優(yōu)于隨機整合轉基因。
　　 4.生長激素轉基因載體構建與細胞水平檢測?？寺》治隽巳恕⒛膛：退５纳L激素基因(GH)，PB轉座子攜帶的GH轉基因載體轉染乳腺細胞和乳腺組織塊，研究GH轉基因的表達對其乳蛋白等基因表達的影響。結果顯示牛、水牛和牦牛之間GH基因的同源性最高，與其它偶蹄目也有較高的同源性，生長激素氨基酸序列也較為保守。將分

10、別攜帶有人和奶牛GH的piggyBac轉座子轉基因載體(pXL-BacII-bCN2.8/hGH2.1-EGFP-Neo，pXL-BacII-bCN2.8/hGH2.2-EGFP-Neo)轉染人的乳腺癌細胞系(Bcap37)，能觀察到EGFP的表達，RT-PCR和western blot均能檢測到人和奶牛GH基因的特異性表達。分別用p18T-bGH和PB-bGH轉基因載體轉染永生化BME細胞后，檢測到bGH轉基因的表達。β酪蛋白、CN1

11、S1酪蛋白和α乳清白蛋白基因表達量均有顯著提高，GHR和IGF1R基因的表達量也有上調。pB-bGH載體轉染的水牛乳腺組織塊，CN1S1，CN1S2，β酪蛋白和κ酪蛋白基因的表達量提高了50倍以上，初步證明GH轉基因載體的轉染可以顯著提高乳蛋白基因的表達水平。
　　 5.轉GH基因水?？寺∨咛サ纳a與早產轉基因克隆水牛的檢測。使用受精卵胞質注射、卵胞質內單精子注射(ICSI)和轉基因體細胞核移植的方法生產轉GH基因的水牛胚胎，并

12、對經(jīng)胚胎移植后的獲得的早產轉基因克隆水牛進行了鑒定。水牛受精卵胞質注射和水牛卵母細胞內單精子注射(ICSI) PB轉座子GH轉基因載體和轉座酶載體后，均獲得EGFP表達的轉基因陽性胚胎。以轉GH基因BFF為核供體，制備了EGFP表達的轉基因克隆水牛囊胚。經(jīng)胚胎移植后獲得了轉GH基因克隆水牛的妊娠，于9月齡早產。特定藍光照射下在早產水牛頭側部能觀察到綠色熒光表達，解剖結果顯示心、肺、肝、胃和脾發(fā)育正常，但大腸，腎臟，生殖系統(tǒng)等發(fā)育不良，而