Agrobacterium tumefaciens GW4加砷條件下的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、砷（Arsenic，As）是一種在自然界中廣泛分布的劇毒類金屬元素，主要以亞砷酸鹽As(Ⅲ)和砷酸鹽As(Ⅴ)的形式存在，可以通過風(fēng)化，火山活動，采礦和生物活動釋放，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。一些原核生物在砷污染環(huán)境中不僅發(fā)展出砷抗性機(jī)制，甚至還能夠通過砷氧化產(chǎn)能。微生物對砷的適應(yīng)性主要依賴不同的砷抗性機(jī)制，包括As(Ⅲ)氧化，細(xì)胞質(zhì)As(Ⅴ)還原，呼吸性As(Ⅴ)還原，As(Ⅲ)甲基化。Agrobacteriumtumefaciens GW

2、4是本實(shí)驗(yàn)室從山西省山陰縣的地下水中分離出的一株革蘭氏陰性菌，具有砷抗性，能將As(Ⅲ)氧化為As(Ⅴ)。在低濃度磷酸鹽條件下，菌體可以在將As(Ⅲ)氧化為As(Ⅴ)的同時，正常生長，且較無砷條件，具有生長優(yōu)勢。本研究通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)建立了A.tumefaciens GW4在低磷濃度分別加砷和無砷條件下的比較蛋白質(zhì)組研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對菌體的砷抗性機(jī)制，加砷條件下的生長優(yōu)勢，以及其砷磷代謝之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。
　　

3、(1)首先對A.tumefaciens GW4的全細(xì)胞蛋白的雙向電泳條件進(jìn)行摸索。結(jié)合菌株的基因組注釋信息和預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH4-7為最適蛋白分離pH范圍。通過菌株生長曲線和As(Ⅲ)氧化曲線的測定，確定了取樣時間點(diǎn)為對數(shù)中期(17 h)和穩(wěn)定期前期(32 h)。
　　 (2)通過雙向電泳技術(shù)分離了有砷和無砷條件下，兩個時間點(diǎn)的蛋白樣品，選取了凝膠上73個高豐度的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，最終鑒定得到50個蛋白質(zhì)

4、。
　　 (3)對鑒定出來的蛋白進(jìn)行功能分類，結(jié)果顯示57％的蛋白與代謝相關(guān)，并主要集中在碳代謝，能量代謝，氨基酸代謝，蛋白質(zhì)合成與翻譯和砷磷代謝。
　　 (4) As(Ⅲ)條件下，在對數(shù)生長中期，菌體的三羧酸循環(huán)受到抑制，而在穩(wěn)定期時，三羧酸循環(huán)上調(diào)。對數(shù)生長中期菌體正呈指數(shù)生長，碳代謝中重要的能量來源減少，磷運(yùn)輸通道蛋白和砷氧化及還原相關(guān)蛋白明顯上調(diào)，說明發(fā)生在對數(shù)期的砷氧化過程很可能同時為細(xì)胞生長提供能量來源。

5、r>　　 (5)菌體的氨基酸代謝下調(diào)，可能是細(xì)胞在As(Ⅲ)條件下，菌體內(nèi)物質(zhì)的合成由菌體本身生長所需要的物質(zhì)過渡到菌體適應(yīng)惡劣環(huán)境所需要的物質(zhì)的合成及形態(tài)的轉(zhuǎn)變，比如砷磷代謝相關(guān)的運(yùn)輸?shù)鞍缀脱趸€原蛋白。
　　 本研究首次建立了A.tumefaciens GW4在微量甘露醇培養(yǎng)基（minimal mannitolmediim，MMN)培養(yǎng)基低磷濃度分別加砷和無砷條件下的比較蛋白質(zhì)組研究。兩種條件下差異蛋白的表達(dá)水平，菌體的代