表乳糖調(diào)控仔豬腸道乳桿菌增殖機(jī)制研究.pdf

1、仔豬健康尤其是仔豬腸道健康對于生豬安全生長至關(guān)重要，如何提高仔豬腸道健康水平是我國生豬養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的一個關(guān)鍵問題。表乳糖(epilactose)是一種稀有二糖型寡糖，由D-半乳糖通過β-1，4糖苷鍵和D-甘露糖連接而成的。據(jù)報道，表乳糖具有益生特性，能顯著提高鈣、鐵離子在大鼠腸道內(nèi)的吸收，促進(jìn)大鼠腸道內(nèi)乳桿菌和雙歧桿菌的增殖。乳桿菌（Lactobacillus spp）是斷奶前仔豬腸道中的優(yōu)勢益生菌之一，對維護(hù)仔豬腸道健康，改善仔豬斷

2、奶綜合癥至關(guān)重要，但關(guān)于表乳糖影響豬腸道乳桿菌生長方面的研究鮮有報道。本論文旨在評價表乳糖對于仔豬腸道微生物的組成影響，揭示表乳糖促進(jìn)仔豬腸道乳桿菌增殖的分子調(diào)控機(jī)理。對減少飼用抗生素促生長劑的使用，改善仔豬腸道健康，推動寡糖替代飼用抗生素產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義。
　　本論文利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建以畢赤酵母為宿主的高效表達(dá)纖維二糖差向異構(gòu)酶的工程菌株。誘導(dǎo)工程菌株生產(chǎn)纖維二糖差向異構(gòu)酶，以乳糖為底物大批量酶法制備表乳糖。

3、采用活性炭層析柱對反應(yīng)混合物分離純化，得到后續(xù)試驗(yàn)所需的表乳糖。在7～10日齡哺乳期健康仔豬的糞便中篩選早期定殖的乳桿菌，利用表乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基，篩選出可利用表乳糖的乳桿菌。利用薄層層析色譜和電噴霧質(zhì)譜測定篩選到的乳桿菌在以表乳糖為唯一碳源生長的代謝產(chǎn)物。利用轉(zhuǎn)錄組測定與表乳糖代謝相關(guān)基因，結(jié)合代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，初步揭示乳桿菌利用表乳糖增殖的分子調(diào)控機(jī)理和代謝途徑。
　　結(jié)果表明，以畢赤酵母為宿主生產(chǎn)的纖維二糖

4、差向異構(gòu)酶酶活力為6.29U/mL，比酶活為274U/mg，酶活力是已報道的以大腸桿菌為宿主表達(dá)的酶的20倍。以200g乳糖為原料制備得到純度為90％的表乳糖331g。在7～10日齡仔豬糞便中分離得到9株乳桿菌，通過16S rDNA測序鑒定為淀粉乳桿菌、卷曲乳桿菌、約氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、短乳桿菌、唾液乳桿菌、豬源乳桿菌、陰道乳桿菌和粘膜乳桿菌。采用碳源利用實(shí)驗(yàn)篩選出可利用表乳糖的3株乳桿菌分別為淀粉乳桿菌、卷曲乳桿菌和唾液乳桿菌。選

5、擇利用表乳糖為唯一碳源增殖的最快的唾液乳桿菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌。薄層層析色譜和電噴霧質(zhì)譜測定結(jié)果表明，在唾液乳桿菌細(xì)胞外隨著培養(yǎng)時間延長表乳糖含量降低，且未檢測到代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，在唾液乳桿菌細(xì)胞內(nèi)檢測到表乳糖，說明唾液乳桿菌將表乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)分解利用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和相關(guān)基因功能的鑒定，確定外源表達(dá)的ORF1794(lacZ)可將表乳糖分解為半乳糖和甘露糖，并在唾液乳桿菌胞內(nèi)檢測到ORF1794(lacZ)的活性隨著唾液乳桿菌生長而升