植物乳桿菌素的分離純化及抑菌機制與合成調控基因分析.pdf

1、食品在低溫保存過程中，經常會受到低溫腐敗菌的污染，低溫腐敗菌產生的耐熱蛋白酶和脂肪酶導致食品腐敗變質。乳酸菌細菌素因其天然、無毒、無殘留、高效的抑菌效果而成為研究與開發(fā)的熱點，但是以nisin為代表的ClassⅠ和大部分ClassⅡ類細菌素主要是對革蘭氏陽性細菌具有抑制作用，而低溫腐敗菌主要是革蘭氏陰性細菌。實驗前期分離出一株產植物乳桿菌素的植物乳桿菌菌株，經抑菌試驗表明該菌株對以熒光假單胞菌為代表的低溫腐敗菌具有很好的抑菌效果，本實驗

2、對該植物乳桿菌素進行分離純化，探究對熒光假單胞菌的抑菌機理，并初步分析植物乳桿菌素合成調控相關基因，具體研究結果如下：
　　采用兩步法快速純化植物乳桿菌素，直接將發(fā)酵液經過SP Sepharose Fast Flow層析柱進行粗純，粗純后收集活性部分進行除鹽濃縮，純化倍數(shù)達到133.11，得率為2％；將上一步純化的活性部分用Superdex Peptide10/300GL凝膠柱純化，純化后收集活性部分，離心濃縮，純化倍數(shù)達到207

3、.8，得率為0.2%。純化后的樣品經Tricine SDS-PAGE初步進行純度和分子量的測定，在4.6kDa左右具有單一蛋白條帶。采用HPLC鑒定樣品純度，在15.341min時，具有單一的吸收峰證明純度較高；LC-ESI/MS精確測定分子量，為4.88kDa，同時通過氨基酸分析儀進行氨基酸成分分析，表明該植物乳桿菌素為一種疏水肽，為進一步的結構和特性分析奠定基礎。
　　從植物乳桿菌素對熒光假單胞菌生長曲線的影響、細胞形態(tài)變化、

4、細胞膜破壞程度、對菌體遺傳物質DNA的影響和生物膜的破壞五個方面探究抑菌機理。結果表明，添加不同濃度植物乳桿菌素對熒光假單胞菌的生長具有明顯影響，在終濃度25.6μg/mL時，植物乳桿菌素可以完全抑制菌體生長，與鏈霉素對熒光假單胞菌生長影響的變化趨勢相似，推測該抗菌物質的作用方式可能是與細胞內物質結合達到殺菌目的；掃描電鏡結果顯示作用前后細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分細胞膜破裂，細胞基質外泄；流式細胞儀結果顯示，隨著植物乳桿菌素含量增加，P

5、I的熒光吸收強度逐漸增強，當植物乳桿菌素終濃度在25.6μg/mL以上時，熒光強度增加量不再明顯，表明該植物乳桿菌素通過破壞菌體細胞膜而起抑菌作用；對生物大分子DNA破壞性的實驗結果表明，DNA條帶沒有消失，彌散或拖尾等，但是隨著植物乳桿菌素濃度增加DNA條帶逐漸變淡，表明該植物乳桿菌素對熒光假單胞菌菌體DNA有破壞作用，但具體作用機制仍需進一步探究；最后研究對熒光假單胞菌生物膜作用，結果表明該抗菌物質可以破壞生物膜，并有部分溶菌作用。