植物乳桿菌素的分離純化及抑菌機(jī)制與合成調(diào)控基因分析.pdf

1、食品在低溫保存過程中，經(jīng)常會(huì)受到低溫腐敗菌的污染，低溫腐敗菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶和脂肪酶導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)。乳酸菌細(xì)菌素因其天然、無毒、無殘留、高效的抑菌效果而成為研究與開發(fā)的熱點(diǎn)，但是以nisin為代表的ClassⅠ和大部分ClassⅡ類細(xì)菌素主要是對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌具有抑制作用，而低溫腐敗菌主要是革蘭氏陰性細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)前期分離出一株產(chǎn)植物乳桿菌素的植物乳桿菌菌株，經(jīng)抑菌試驗(yàn)表明該菌株對(duì)以熒光假單胞菌為代表的低溫腐敗菌具有很好的抑菌效果，本實(shí)驗(yàn)

2、對(duì)該植物乳桿菌素進(jìn)行分離純化，探究對(duì)熒光假單胞菌的抑菌機(jī)理，并初步分析植物乳桿菌素合成調(diào)控相關(guān)基因，具體研究結(jié)果如下：
　　采用兩步法快速純化植物乳桿菌素，直接將發(fā)酵液經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow層析柱進(jìn)行粗純，粗純后收集活性部分進(jìn)行除鹽濃縮，純化倍數(shù)達(dá)到133.11，得率為2％；將上一步純化的活性部分用Superdex Peptide10/300GL凝膠柱純化，純化后收集活性部分，離心濃縮，純化倍數(shù)達(dá)到207

3、.8，得率為0.2%。純化后的樣品經(jīng)Tricine SDS-PAGE初步進(jìn)行純度和分子量的測(cè)定，在4.6kDa左右具有單一蛋白條帶。采用HPLC鑒定樣品純度，在15.341min時(shí)，具有單一的吸收峰證明純度較高；LC-ESI/MS精確測(cè)定分子量，為4.88kDa，同時(shí)通過氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸成分分析，表明該植物乳桿菌素為一種疏水肽，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和特性分析奠定基礎(chǔ)。
　　從植物乳桿菌素對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響、細(xì)胞形態(tài)變化、

4、細(xì)胞膜破壞程度、對(duì)菌體遺傳物質(zhì)DNA的影響和生物膜的破壞五個(gè)方面探究抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，添加不同濃度植物乳桿菌素對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)具有明顯影響，在終濃度25.6μg/mL時(shí)，植物乳桿菌素可以完全抑制菌體生長(zhǎng)，與鏈霉素對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)影響的變化趨勢(shì)相似，推測(cè)該抗菌物質(zhì)的作用方式可能是與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合達(dá)到殺菌目的；掃描電鏡結(jié)果顯示作用前后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，部分細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞基質(zhì)外泄；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，隨著植物乳桿菌素含量增加，P

5、I的熒光吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)植物乳桿菌素終濃度在25.6μg/mL以上時(shí)，熒光強(qiáng)度增加量不再明顯，表明該植物乳桿菌素通過破壞菌體細(xì)胞膜而起抑菌作用；對(duì)生物大分子DNA破壞性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA條帶沒有消失，彌散或拖尾等，但是隨著植物乳桿菌素濃度增加DNA條帶逐漸變淡，表明該植物乳桿菌素對(duì)熒光假單胞菌菌體DNA有破壞作用，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究；最后研究對(duì)熒光假單胞菌生物膜作用，結(jié)果表明該抗菌物質(zhì)可以破壞生物膜，并有部分溶菌作用。