GPR48在創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進程中的表達調(diào)控.pdf

1、目的:通過SD大鼠體內(nèi)和體外實驗，探討創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進程中關(guān)節(jié)軟骨GPR48表達變化及其與炎癥免疫反應因子之間的表達聯(lián)控關(guān)系，嘗試進一步揭示創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進程中內(nèi)在分子機制，為創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎的研究和治療提供新思路。
　　方法:
　?。ˋ）體外實驗：SPF級雌性4周齡SD大鼠21只，應用頸椎脫臼法處死大鼠，醫(yī)用酒精浸泡30min，嚴格無菌條件下取軟骨組織，眼科剪剪碎組織法進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，用甲苯胺藍染色法和COL-

2、II免疫細胞化學染色法進行軟骨細胞鑒定。取第3代細胞隨機分為加完全培養(yǎng)基組（對照組）、LPS（濃度為20?g/mL）干預組和IL-1β（濃度為10ng/mL）干預組；三組分別在0.5h、1h、6h、24h、48h后，提取各時間點細胞蛋白，BCA法進行蛋白含量測定，應用Western Blot法檢測GPR48、TLR4蛋白的表達，ImageJ半定量分析蛋白表達。
　　（B）體內(nèi)實驗：SPF級雌性4周齡SD大鼠48只，隨機分為對照組和

3、實驗組，對照組12只，實驗組36只。實驗組大鼠行雙側(cè)前交叉韌帶（ACL）橫斷、內(nèi)側(cè)半月板切除誘導 PTOA，大鼠對照組膝關(guān)節(jié)打開關(guān)節(jié)囊后即逐層縫合（行假手術(shù)），兩組動物按2w、4w、6w末分別處死并取膝關(guān)節(jié)標本，4％多聚甲醛固定2周，EDTA脫鈣2個月，石蠟包埋切片后，進行一般染色（HE）和特殊染色（Masson、VG）觀察，免疫組織化學染色法檢測關(guān)節(jié)軟骨GPR48、COL-II和TLR4蛋白的表達；光學顯微鏡下觀察并應用IRS評分標準

4、進行評分。應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，采用單因素方差分析檢驗方法和Pea rso n相關(guān)性分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　?。ˋ）體外實驗：
　　1.甲苯胺藍染色：正常軟骨細胞分泌特征性的酸性糖胺多糖能被甲苯胺藍染成紫紅色，軟骨細胞甲苯胺藍染色后呈異染性。
　　2.COL-II免疫細胞化學染色法：COL-II是軟骨細胞特異性的分泌物，因此采用COL-II免疫細胞化學

5、染色證明軟骨細胞COL-II呈陽性表達，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。
　　3.Western Blot法檢測GPR48和TLR4因子的表達：隨干預時間延長，實驗組（LPS和IL-1β）中GPR48表達逐漸降低（P＜0.05），對照組中GPR48表達在不同時間點間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TLR4在實驗組（LPS和IL-1β組）中隨干預時間延長表達逐漸升高（P＜0.05），對照組中TLR4表達在不同干預時間點間差異無統(tǒng)計學意義（P

6、＞0.05）。IL-1β干預組不同時間點間GPR48與TLR4表達量之間呈負相關(guān)（r=－0.991，P＜0.05）；LPS干預組不同時間點間GPR48與TLR4表達量之間呈負相關(guān)（r=－0.997，P＜0.05）。
　?。˙）體內(nèi)實驗：成功制備出SD大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎動物模型。
　　1.關(guān)節(jié)軟骨HE染色：對照組膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨陷窩內(nèi)軟骨細胞排列整齊、規(guī)則，軟骨下骨小梁粗大完整。實驗組2w膝關(guān)節(jié)面相對較好，可見軟骨陷

7、窩內(nèi)軟骨細胞排列較整齊，可見細胞簇聚，軟骨下骨小梁排列較好，骨小梁厚度增加；實驗組4w可見軟骨表層細胞丟失，有細胞克隆出現(xiàn)，細胞形態(tài)比較正常，排列較紊亂，軟骨下骨小梁增多，小梁間間隙變小。實驗組6w可見軟骨細胞丟失嚴重，細胞形態(tài)異常，且細胞排列紊亂，潮線前移，軟骨下骨小梁增多，小梁間間隙更小，且排列紊亂。
　　2.關(guān)節(jié)軟骨Masso n三色染色：結(jié)果可見軟骨基質(zhì)膠原纖維染成藍色，紅細胞及肌纖維呈紅色，細胞核呈藍黑色。實驗組可見軟骨

8、基質(zhì)隨時間延長而減少，基質(zhì)染色變淺，紅染區(qū)減少；對照組無明顯變化，且實驗組與對照組單位面積內(nèi)膠原含量2w、4w、6w相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.關(guān)節(jié)軟骨VG染色：結(jié)果可見膠原纖維染紅色。實驗組可見軟骨基質(zhì)隨時間延長而減少，基質(zhì)染色變淺，紅染區(qū)減少。對照組無明顯變化。且實驗組與對照組單位面積內(nèi)膠原含量2w、4w、6w相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.免疫組織化學染色檢測關(guān)節(jié)軟骨中GP

9、R48與 COL-II、TLR4：GPR48與COL-II蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒，均可在軟骨細胞表達；實驗組各時間點GPR48與COL-II蛋白的表達都低于對照組（P＜0.05）。TLR4蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒，位于細胞膜和細胞漿，主要表達于軟骨細胞，成骨細胞和骨細胞也可見少量表達。實驗組各個時間點 TLR4蛋白的表達均高于對照組（P＜0.05），實驗組不同時間點GPR48與TLR4蛋白的表達呈負相關(guān)（r=－0.925，P＜0.

10、05）。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗成功復制了SD大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎模型，并在一定程度上反映出了骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化，為后期研究建立了良好的平臺。
　　2.體外實驗表明，關(guān)節(jié)軟骨細胞在炎性因子IL-1β、LPS分別刺激下，GPR48表達下調(diào)，TLR4上調(diào)，兩者之間表達量呈負相關(guān)關(guān)系，表明炎性環(huán)境下，GPR48負性調(diào)控軟骨細胞的免疫炎癥反應。
　　3.體內(nèi)實驗表明，隨創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展，關(guān)節(jié)軟骨GPR48表