GPR48在小鼠眼瞼發(fā)育過程中的作用研究.pdf

1、目的： 眼瞼發(fā)育是一個特殊的形態(tài)發(fā)生過程，牽涉到細胞增殖、分化、和遷移等，并且受到多種生長因子和細胞因子的調(diào)控。Gpr48基因敲除小鼠存在出生時眼瞼閉合不全(EOB)表型。本文重點研究Gpr48基因敲除小鼠EOB表型產(chǎn)生的病理原因，闡明GPR48在調(diào)控眼瞼發(fā)育中的重要作用，并對GPR48調(diào)控眼瞼發(fā)育的機制進行初步探討。 方法： 采用組織形態(tài)學H&E染色和掃描電鏡法確定EOB表型，應用X-gal染色確定GPR48的

2、表達特點。用BrdU液注射懷孕母鼠，取胚胎小鼠頭部制成石蠟切片，用相應的抗BrdU單克隆抗體原位檢測胚胎眼瞼部位的細胞增殖情況；培養(yǎng)原代新生小鼠上皮細胞和成纖維細胞，用BrdU法檢測體外培養(yǎng)細胞的增殖能力。采用體外細胞創(chuàng)傷劃痕法比較Gpr48+/+與Gpr48-/-細胞的遷移能力。在闡明GPR48調(diào)控眼瞼發(fā)育的分子機制時應用了Western blot和免疫組化法檢測相關(guān)基因的表達水平，并且進一步用細胞功能實驗進行驗證。 結(jié)果：

3、 (1)X-gal染色顯示：在胚胎發(fā)育過程中，GPR48高度表達于眼瞼表皮基底層細胞和眼瞼頭部間充質(zhì)細胞。(2)H&E染色顯示Gpr48-/-胚胎眼瞼閉合遲緩，甚至于出生時還未閉合，表現(xiàn)EOB；掃描電鏡顯示Gpr48-/-胚胎眼瞼邊緣特別是內(nèi)外眥處圓形周皮細胞顯著減少，高倍放大可見上皮細胞表面絨毛明顯短而少。(3)對體外培養(yǎng)的新生小鼠皮膚上皮細胞和成纖維細胞，進行BrdU增殖實驗和劃痕實驗，顯示GPR48能夠影響細胞的增殖和遷移，

4、并且只是對上皮細胞有作用，對成纖維細胞無影響；F-actin免疫熒光顯示Gpr48-/-細胞內(nèi)的骨架蛋白、肌動蛋白張力絲以及細胞周圍的絲狀偽足等明顯減少，這可能是Gpr48-/-細胞的遷移能力減弱的原因。(4)Western blot實驗顯示在Gpr48-/-上皮角質(zhì)化細胞中p-EGFR水平明顯下降，但p-c-Jun和p-Akt無明顯變化，同時在用免疫組化法檢測其在眼瞼部位的原位表達時也得到相同的結(jié)果。并在細胞功能實驗中得到進一步的認證