GPR48在小鼠眼瞼發(fā)育過程中的作用研究.pdf

1、目的： 眼瞼發(fā)育是一個(gè)特殊的形態(tài)發(fā)生過程，牽涉到細(xì)胞增殖、分化、和遷移等，并且受到多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的調(diào)控。Gpr48基因敲除小鼠存在出生時(shí)眼瞼閉合不全(EOB)表型。本文重點(diǎn)研究Gpr48基因敲除小鼠EOB表型產(chǎn)生的病理原因，闡明GPR48在調(diào)控眼瞼發(fā)育中的重要作用，并對(duì)GPR48調(diào)控眼瞼發(fā)育的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 采用組織形態(tài)學(xué)H&E染色和掃描電鏡法確定EOB表型，應(yīng)用X-gal染色確定GPR48的

2、表達(dá)特點(diǎn)。用BrdU液注射懷孕母鼠，取胚胎小鼠頭部制成石蠟切片，用相應(yīng)的抗BrdU單克隆抗體原位檢測(cè)胚胎眼瞼部位的細(xì)胞增殖情況；培養(yǎng)原代新生小鼠上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，用BrdU法檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力。采用體外細(xì)胞創(chuàng)傷劃痕法比較Gpr48+/+與Gpr48-/-細(xì)胞的遷移能力。在闡明GPR48調(diào)控眼瞼發(fā)育的分子機(jī)制時(shí)應(yīng)用了Western blot和免疫組化法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平，并且進(jìn)一步用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：

3、 (1)X-gal染色顯示：在胚胎發(fā)育過程中，GPR48高度表達(dá)于眼瞼表皮基底層細(xì)胞和眼瞼頭部間充質(zhì)細(xì)胞。(2)H&E染色顯示Gpr48-/-胚胎眼瞼閉合遲緩，甚至于出生時(shí)還未閉合，表現(xiàn)EOB；掃描電鏡顯示Gpr48-/-胚胎眼瞼邊緣特別是內(nèi)外眥處圓形周皮細(xì)胞顯著減少，高倍放大可見上皮細(xì)胞表面絨毛明顯短而少。(3)對(duì)體外培養(yǎng)的新生小鼠皮膚上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，進(jìn)行BrdU增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，顯示GPR48能夠影響細(xì)胞的增殖和遷移，

4、并且只是對(duì)上皮細(xì)胞有作用，對(duì)成纖維細(xì)胞無影響；F-actin免疫熒光顯示Gpr48-/-細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白、肌動(dòng)蛋白張力絲以及細(xì)胞周圍的絲狀偽足等明顯減少，這可能是Gpr48-/-細(xì)胞的遷移能力減弱的原因。(4)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示在Gpr48-/-上皮角質(zhì)化細(xì)胞中p-EGFR水平明顯下降，但p-c-Jun和p-Akt無明顯變化，同時(shí)在用免疫組化法檢測(cè)其在眼瞼部位的原位表達(dá)時(shí)也得到相同的結(jié)果。并在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步的認(rèn)證