糖尿病小鼠腎小球入球動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮素-1的反應(yīng)性變化及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病血管病變是糖尿病發(fā)病率和死亡率居高的重要因素。糖尿病影響血管功能，導(dǎo)致胰腺、腎、視網(wǎng)膜及神經(jīng)等微血管并發(fā)癥。內(nèi)皮功能障礙是加速糖尿病血管病變的始發(fā)因素并與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為血管舒張因子與血管收縮因子之間的失衡。內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是作用最強(qiáng)的血管收縮因子，亦是參與糖尿病血管病變發(fā)生及加速血管并發(fā)癥的重要因素。然而，迄今為止ET-1對(duì)糖尿病微血管的作用機(jī)制尚不明確，而對(duì)小血管和

2、微血管的深入研究更能揭示糖尿病及其血管并發(fā)癥的病理機(jī)制。
　　越來(lái)越多的人體或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病狀態(tài)下存在明顯的氧化還原平衡失衡，活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)過(guò)量產(chǎn)生是其主要特點(diǎn)，主要包括超氧陰離子(Superoxide anion，O2·-)和過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)。者作為體內(nèi)主要的氧化還原代謝產(chǎn)物，并作為重要的信息傳遞分子影響血管活性。糖尿病狀態(tài)下的O2·

3、-及H2O2基礎(chǔ)水平均明顯升高，ET-1進(jìn)一步刺激組織釋放O2·-。ET-1刺激培養(yǎng)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性降低以及H2O2聚集，進(jìn)而影響肺血流量。這些研究強(qiáng)烈提示氧化應(yīng)激參與血管對(duì)ET-1的反應(yīng)性。
　　糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)存在Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的異常，如Wnt5a和β-catenin表達(dá)量的下降。有文獻(xiàn)顯示，轉(zhuǎn)染特異的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑Dickkopf1(DKK1)能顯著增加ROS水平。Nucleor

4、edoxin(NRX)作為硫氧還原蛋白家族的重要成員，通過(guò)作用于散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)，負(fù)性調(diào)控Wnt信號(hào)通路。研究表明，H2O2可以抑制環(huán)連蛋白(β-catenin)/T細(xì)胞因子(T cell factor, TCF)的轉(zhuǎn)錄活性，高表達(dá)Dvl能改善這種抑制作用。比較有趣的是，也有研究報(bào)道了截然相反的結(jié)果，即H2O2作用于細(xì)胞后增加了糖原合成激酶-3β(Glycogensynthasekinase-3β，GSK3β)

5、的去磷酸化，并暫時(shí)性激活TCF。以上研究結(jié)果均表明Wnt信號(hào)通路與氧化應(yīng)激之間存在一定的關(guān)聯(lián)。
　　那么，糖尿病模型小鼠腎小球入球動(dòng)脈對(duì)ET-1的反應(yīng)性是否增強(qiáng)？增強(qiáng)的ET-1反應(yīng)性是否與氧化應(yīng)激異常相關(guān)？糖尿病動(dòng)物模型是否存在經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的異常？經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路與氧化應(yīng)激是否存在關(guān)聯(lián)？采用Wnt信號(hào)通路特異性抑制劑能否削弱糖尿病狀態(tài)下增強(qiáng)的ET-1反應(yīng)性？針對(duì)這些問(wèn)題，本課題采用世界尖

6、端的、國(guó)內(nèi)首創(chuàng)的微動(dòng)脈微灌注技術(shù)，集中研究糖尿病動(dòng)物模型及培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路與氧化應(yīng)激相關(guān)分子的關(guān)系，以探討糖尿病血管并發(fā)癥的相關(guān)分子機(jī)制。
　　第一部分:氧化應(yīng)激在糖尿病小鼠腎小球入球動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮素-1反應(yīng)性中的作用
　　目的:
　　本研究通過(guò)構(gòu)建C57BL/6小鼠糖尿病模型，探討該模型下小鼠腎小球入球動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮素-1的反應(yīng)性及氧化應(yīng)激作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過(guò)

7、給C57BL/6小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(70 mg/kg/d)連續(xù)四天，構(gòu)建糖尿小鼠模型，腹腔注射等體積枸櫞酸-枸櫞酸鈉的C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組，每組均為10只。
　　2.采用世界尖端的、國(guó)內(nèi)首創(chuàng)的、難度較高的顯微微灌注技術(shù)比較兩組小鼠腎小球入球動(dòng)脈對(duì)ET-1的反應(yīng)性，并確定不同類型ET-1受體的作用。
　　3.采用不同類型ROS清除劑孵育兩組小鼠腎小球入球動(dòng)脈，探明H2O2和O2·-在不同條件介導(dǎo)的ET-1血管反

8、應(yīng)性中的作用。
　　4.比較兩組小鼠腎小球入球動(dòng)脈在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)H2O2（10μM）的反應(yīng)性。
　　5.采用熒光探針?lè)z測(cè)顯微微灌注的兩組小鼠腎小球入球動(dòng)脈中的基礎(chǔ)及ET-1刺激下的ROS熒光信號(hào)。
　　6.采用Western blot法檢測(cè)兩組小鼠球前動(dòng)脈中ETA和ETB受體蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.糖尿病條件下，腎小球入球動(dòng)脈對(duì)ET-1的反應(yīng)性增強(qiáng)，且增強(qiáng)的反應(yīng)主要由ETB受體調(diào)節(jié);正常條件下的

9、ET-1血管反應(yīng)性主要由ETA受體調(diào)節(jié)。
　　2.糖尿病條件下，球前動(dòng)脈ETA和ETB受體蛋白表達(dá)均明顯增多。
　　3.糖尿病條件下，H2O2和O2·-均參與增強(qiáng)的ET-1血管反應(yīng)性。
　　4.H2O2呈時(shí)間依賴性收縮糖尿病條件下的腎小球入球動(dòng)脈。
　　5.糖尿病條件下基礎(chǔ)的H2O2和O2·-熒光增多，ET-1呈濃度依賴性方式誘導(dǎo)更多的O2·-，但不影響H2O2的釋放。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，糖

10、尿病增強(qiáng)腎小球入球動(dòng)脈對(duì)ET-1的反應(yīng)性，且這種效應(yīng)主要由ETB受體調(diào)節(jié)，H2O2和O2·-共同參與此過(guò)程。ET-1能促進(jìn)腎小球入球動(dòng)脈O2·-釋放，但不影響H2O2的釋放。
　　第二部分:經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在糖尿病小鼠內(nèi)皮素-1血管反應(yīng)性中的作用及對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響
　　目的:
　　本研究探討經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在糖尿病模型小鼠ET-1血管反應(yīng)性中的作用及對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響。

11、
　　方法:
　　1.C57BL/6小鼠糖尿病模型構(gòu)建成功第二天開(kāi)始給予舒林酸(sulindac)處理，按照40 mg/kg/d劑量灌胃給藥，連續(xù)四周，同期對(duì)照組接受等量等體積sulindac。實(shí)驗(yàn)共分成四組:對(duì)照組（Control組），對(duì)照組+sulindac（Control+S組），糖尿病組（DM組）及糖尿病組+sulindac（DM+S組），每組均為10只。
　　2.采用Western blot和real-tim

12、e PCR法檢測(cè)不同模型小鼠球前動(dòng)脈中Wnt信號(hào)分子的表達(dá)。
　　3.采用Western blot和real-time PCR法檢測(cè)不同模型小鼠球前動(dòng)脈中抗氧化應(yīng)激分子的表達(dá)，評(píng)估Wnt信號(hào)通路在抗氧化應(yīng)激水平的作用。
　　4.比較不同模型小鼠球前動(dòng)脈中H2O2和O2·-濃度及過(guò)氧化氫酶(CAT)和總超氧化物歧化酶(SOD)活力大小，評(píng)估Wnt信號(hào)通路的功能。
　　5.采用顯微微灌注技術(shù)比較不同模型小鼠腎小球入球動(dòng)脈對(duì)

13、ET-1的血管反應(yīng)性。
　　6.采用熒光探針?lè)z測(cè)顯微微灌注的不同模型小鼠腎小球入球動(dòng)脈中的基礎(chǔ)和ET-1刺激下的ROS熒光信號(hào)，評(píng)估Wnt信號(hào)通路的功能。
　　結(jié)果:
　　1.糖尿病激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，抑制Wnt信號(hào)通路后氧化應(yīng)激分子H2O2和O2·-含量減少，catalase和總SOD酶活力回升，抗氧化應(yīng)激蛋白分子catalase和SOD2表達(dá)上調(diào)。
　　2.Sulindac通過(guò)減少糖尿病下增多的H2O2

14、和O2·-，削弱增強(qiáng)的ET-1血管反應(yīng)性。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，糖尿病激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，抑制該通路活性后，H2O2和O2·-降放減少，從而削弱了增強(qiáng)的ET-1血管反應(yīng)性。
　　第三部分:高糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)氧化應(yīng)激水平
　　目的:
　　高糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，探討經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路與氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生過(guò)程中的作用。

15、　　方法:
　　1.HUVECs中加入不同濃度葡萄糖(5.5，25，50，75，100 mM)培養(yǎng)24或48 h;加入不同濃度sulindac（0.15，0.25，0.5mM）培養(yǎng)24或48 h;在高糖(50mM)培養(yǎng)24或48 h的基礎(chǔ)上加入不同濃度sulindac(0.15，0.25，0.5 mM)繼續(xù)培養(yǎng)1h。
　　2.葡萄糖或sulindac或葡萄糖+sulindac處理后，行細(xì)胞活力檢測(cè)確定二者理想濃度。
　

16、　3.葡萄糖或葡萄糖+sulindac處理后，采用Western blot和real-time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt信號(hào)分子的表達(dá)，并設(shè)立26.5 mM甘露醇作為對(duì)照組排除滲透壓所帶來(lái)的影響。
　　4.葡萄糖或葡萄糖+sulindac處理后，采用Western blot和real-time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中抗氧化應(yīng)激分子的表達(dá)，評(píng)估Wnt信號(hào)通路在抗氧化應(yīng)激水平的作用。
　　5.葡萄糖或葡萄糖+sulindac

17、處理后，檢測(cè)細(xì)胞中ROS熒光信號(hào)，評(píng)估Wnt信號(hào)通路的功能。
　　6.葡萄糖+sulindac處理后，加入tempol(1 mM)作用1h，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中抗氧化應(yīng)激分子及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，評(píng)估氧化應(yīng)激影響Wnt信號(hào)通路活性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.葡萄糖呈濃度依賴性減少HUVECs活力，0.5 mM sulindac作用后恢復(fù)HUVECs低活力狀態(tài)。
　　2.50 m

18、M葡萄糖作用HUVECs24或48 h模擬糖尿病高氧化應(yīng)激，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路被激活。抑制Wnt信號(hào)通路后，細(xì)胞中H2O2和O2·-釋放減少，catalase和SOD2表達(dá)上調(diào)，此作用獨(dú)立于滲透壓變化。
　　3.Tempol增加高糖所致的SOD2低表達(dá)，不影響catalase表達(dá)，不影響經(jīng)典Wnt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，高糖激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，抑制該通路活性后，H2O2和O2·-釋放減少，