雌、孕激素對(duì)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響.pdf

1、心肌肥大是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，是心力衰竭的前驅(qū)病變，其潛在危害已越來越受到重視。目前己明確內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是心肌細(xì)胞強(qiáng)大的促生長(zhǎng)因子，可作為重要的致肥厚因子參與心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。深入探討心肌肥大的發(fā)病機(jī)制、尋求合理有效的防治措施是心血管領(lǐng)域長(zhǎng)期關(guān)注的重大研究課題。研究證實(shí)，雌激素對(duì)心臟具有保護(hù)效應(yīng)，可以通過抗高血壓、對(duì)心臟的直接作用(通過雌激素受體)以及觸發(fā)一些心臟保護(hù)因子的釋

2、放等來抑制多種刺激因素所致的心肌肥大反應(yīng)，但是其具體機(jī)制至今尚未完全闡明。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)家族是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，屬絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族，廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，其成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinases，ERK1/2，p42/p44MAPK)與細(xì)胞生長(zhǎng)、分

3、化和增殖的調(diào)控關(guān)系尤為密切。MAPKs激活在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有兩個(gè)重要特征：(1)激活核轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；(2)整合不同受體系統(tǒng)介導(dǎo)的信息，起著多種信號(hào)共同通路的作用。我室既往的研究證實(shí)，ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)與ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)；而且在對(duì)血管的研究中也發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)可以通過抑制ERK1/2的活性和蛋白表達(dá)來抑制血管損傷后血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecel

4、l，VSMC)的增殖。這就提示我們E2也可能通過調(diào)節(jié)ERK1/2的活性和蛋白表達(dá)來抑制ET-1誘導(dǎo)的心細(xì)胞肥大反應(yīng)。 ERK1/2激活后主要被細(xì)胞內(nèi)的磷酸酶去磷酸化而失活。在心肌細(xì)胞，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activatedproteinkinasephosphatase-1，MKP-1)為目前發(fā)現(xiàn)的最重要的MAPK磷酸酶，對(duì)ERK1/2的去磷酸化調(diào)節(jié)有較高的特異性。有研究表明，MKP-1的過表達(dá)可以抑制

5、ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，但是，促進(jìn)MKP-1mRNA和蛋白表達(dá)增加的機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。因此，研究MKP-1對(duì)ERK1/2的失活作用及與E2抑制心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的關(guān)系，對(duì)闡明E2抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)機(jī)制具有重要的意義。 雖然雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用已經(jīng)得到肯定，但是婦女絕經(jīng)后，長(zhǎng)期大量使用雌激素替代治療(estrogenreplacementtherapy，ERT)可增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，因

6、而在一定程度上限制了它在臨床上的應(yīng)用。大量的臨床試驗(yàn)證實(shí)加用小量孕激素可降低子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率，但同時(shí)可能抵消雌激素的部分心血管保護(hù)作用。雖然，孕激素單獨(dú)作用及雌孕激素聯(lián)合運(yùn)用對(duì)心血管系統(tǒng)功能的影響已有一些初步的研究，但結(jié)果目前還存在爭(zhēng)議，而且對(duì)心肌肥大反應(yīng)的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。因此為尋找一種安全有效的臨床激素替代治療方案需要進(jìn)一步深入的探討雌、孕激素對(duì)心血管系統(tǒng)的作用及其機(jī)制。 綜上所述，本課題主要利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)

7、胞，用ET-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，采用Bradford法、同位素法、免疫印跡法等技術(shù)，從細(xì)胞和分子水平探討E2在ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)中的作用及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并且初步探討孕激素(Progesterone，P)單獨(dú)使用以及雌孕激素聯(lián)合運(yùn)用對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響，為雌激素的心血管保護(hù)作用機(jī)制提供新的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)有助于進(jìn)一步加深對(duì)性激素在心血管系統(tǒng)作用的了解，這對(duì)于臨床心肌肥厚等心血管疾病的防治具有積極

8、意義，而且也為絕經(jīng)后婦女應(yīng)用激素替代療法時(shí)合理聯(lián)用孕激素提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。 論文主要包括以下兩個(gè)部分： 第1章17β-雌二醇對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響及其機(jī)制 1.117β-雌二醇對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響 1.2ERK1/2信號(hào)途徑在17β-雌二醇抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)中的作用第2章孕激素單獨(dú)使用及雌孕激素聯(lián)合運(yùn)用對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響 方法：1

9、、差速貼壁法分離、純化培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細(xì)胞，以ET-1刺激心肌細(xì)胞建立心肌肥大細(xì)胞模型； 2、以Bradford法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量、IBAS圖像分析處理系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞表面積、同位素法分析[3H]-亮氨酸(3H-leucine，3H-leu)摻入來作為心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的指標(biāo)； 3、以免疫印跡法檢測(cè)心肌細(xì)胞中磷酸化ERK1/2、ERK1/2總蛋白及MKP-1蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：1、10-10～10

10、-7mol/L的ET-1作用于心肌細(xì)胞24h后顯著增加新生大鼠心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞表面積和3H-leu摻入，在10-10～10-7mol/L范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴性，以10-8mol/L作用最強(qiáng)；10-8mol/LET-1作用于心肌細(xì)胞12h、24h、36h、48h均增加新生大鼠心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和3H-leu摻入，其中以作用24h時(shí)效應(yīng)最強(qiáng)；10-6mol/LBQ123預(yù)處理30min可抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的增加，

11、而BQ123單獨(dú)作用對(duì)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量沒有影響。 2、10-10～10-6mol/L的E2預(yù)處理24h后可明顯抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞表面積和3H-leu摻入的增加，其中以10-8mol/LE2作用最為明顯；預(yù)先給予10-6mol/LTamoxifen(Ta)作用30min，可部分抑制E2降低ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞3H-leu摻入增加的作用，單獨(dú)給予Ta對(duì)心肌細(xì)胞3H-leu摻入沒有顯著影響；PD98059(

12、50μmol/L)預(yù)處理1h可抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞3H-leu摻入的增加，并且使E2對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞3H-leu摻入增加的抑制作用加強(qiáng)。 3、10-8mol/LET-1作用5min使心肌細(xì)胞的ERK1/2活性顯著增加，給予10-8mol/LE2預(yù)處理3h可以抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERK1/2活性增加，單獨(dú)給予E2對(duì)ERK1/2活性無明顯影響，在這一過程中心肌細(xì)胞ERK1/2總蛋白表達(dá)無明顯變化；10-6mol/

13、LTa預(yù)處理30min可逆轉(zhuǎn)E2對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERK1/2活性增加的抑制作用，單獨(dú)給予Ta對(duì)ERK1/2活性無明顯影響。 4、10-8mol/LET-1作用5min使心肌細(xì)胞的MKP-1蛋白表達(dá)增加；給予10-8mol/LE2預(yù)處理3h使ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MKP-1蛋白表達(dá)量進(jìn)一步增加；單獨(dú)給予E2對(duì)心肌細(xì)胞MKP-1蛋白表達(dá)無明顯影響。 5、10-10～10-6mol/LP預(yù)處理24h對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌

14、細(xì)胞3H-leu摻入、蛋白質(zhì)含量的增加無顯著影響；雌孕激素聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，10-6mol/L的P對(duì)10-6、10-8mol/L的E2降低ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞3H-leu摻入增加的作用具有明顯的抑制作用，這種抑制作用不存在明顯的劑量—效應(yīng)相關(guān)，而當(dāng)E2的濃度為10-10mol/L時(shí)，同樣10-6mol/L的P對(duì)E2的作用則未見顯著影響，E2與P的其他濃度聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，P對(duì)E2降低ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞3H-leu摻入增加的作用均無明顯的抑制。

15、 結(jié)論：1、ET-1可由ETAR介導(dǎo)呈濃度和時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)；E2可抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，且這一作用至少部分是由雌激素受體介導(dǎo)的。 2、E2抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)與ERK1/2信號(hào)途徑密切相關(guān)：E2可通過增加心肌細(xì)胞MKP-1蛋白表達(dá)，抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERK1/2活性增高，從而抑制ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。 3、單獨(dú)使用P對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)無