四君子湯對煙曲霉菌生長和毒性代謝的抑制作用以及相關(guān)分子機制的研究.pdf

1、目的：
　　 觀察四君子湯對煙曲霉菌體外生長繁殖和毒性代謝產(chǎn)物的抑制作用；對孢子萌芽相關(guān)基因(pkaCl)表達(dá)調(diào)節(jié)的影響；以及對感染小鼠的煙曲霉菌生長與致炎癥反應(yīng)的抑制作用。
　　 方法：
　　 1四君子湯對煙曲霉菌體外生長的抑制作用：不同劑量的四君子湯和氟康唑處理的103個煙曲霉菌孢子均勻涂布在沙氏固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d，計算并比較煙曲霉菌生長形成的菌落數(shù)量、菌落大小、鏡下計數(shù)孢子柄與孢子的數(shù)量。
　　

2、2四君子湯對煙曲霉菌毒性代謝產(chǎn)物的抑制作用
　　 2.1四君子湯處理的孢子培養(yǎng)濾液的細(xì)胞毒性試驗：將不同劑量中藥處理的孢子培養(yǎng)濾液對倍稀釋，與103個HeLa細(xì)胞于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，臺盼藍(lán)染色法計算各孔活細(xì)胞數(shù)。計數(shù)每組的細(xì)胞存活率％與觀察抑制50％細(xì)胞生長的濾液稀釋度。
　　 2.2四君子湯處理的孢子培養(yǎng)濾液溶解紅細(xì)胞試驗：將不同中藥組處理的孢子培養(yǎng)濾液各900μL分別與100μL104雞紅細(xì)胞于EP管

3、內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)24h，每組設(shè)5管，計數(shù)各組的紅細(xì)胞平均存活率。
　　 2.3四君子湯對過氧化氫殺煙曲霉菌孢子的影響：將2x106孢子與20 mL沙氏固體培養(yǎng)基混勻倒板，培養(yǎng)基中間打直徑約為1cm小孔，分別加入不同劑量中藥和生理鹽水，置37℃，使藥液充分?jǐn)U散與孢子作用1h后。小孔內(nèi)加100μL0.3％的H2O2，37℃培養(yǎng)48h后，測量抑菌圈直徑大小并計算其均數(shù)。
　　 3 RT-PCR測定pkaCl基因的表達(dá)：不同劑

4、量的中藥作用孢子1h，提取孢子總RNA，RT-PCR檢測各個組孢子pkaCl和actin基因的表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳，掃描測定PCR產(chǎn)物條帶的灰度密度值，每組以pkaCl和actin灰度密度值的比值作為目的基因pkaCl相對表達(dá)量。
　　 4四君子湯對感染小鼠干預(yù)效果觀察：小鼠感染煙曲霉菌后，連續(xù)4d服用不同劑量的中藥，無菌法分離肺組織用于：1)制作病理切片以觀察各組小鼠肺組織的病理反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤；2)組織研碎接種沙氏培養(yǎng)基，

5、37℃培養(yǎng)4天，計算菌落數(shù)，以觀察各組小鼠肺組織真菌的荷載。
　　 結(jié)果：
　　 1四君子湯對煙曲霉菌體外生長的抑制作用：與對照組相比，四君子湯和氟康唑可以顯著降低煙曲霉菌的菌落數(shù)量和菌落大小，抑制孢子柄與孢子的的形成(p<0.05)，結(jié)果呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。與氟康唑處理組相比，300μL四君子湯處理的分生孢子形成的菌落數(shù)、菌落大小和孢子柄和產(chǎn)生的分生孢子數(shù)均顯著低于氟康嘩處理組(P<0.05)。
　　 2四君子

6、湯對煙曲霉菌毒性代謝產(chǎn)物的抑制作用：四君子湯處理的煙曲霉菌孢子培養(yǎng)液濾液作用的HeLa細(xì)胞和紅細(xì)胞生存率顯著高于無藥物處理組(P<0.05)，抑制50％細(xì)胞的藥物組孢子培養(yǎng)液濾液的稀釋度低于無藥物組，結(jié)果均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；100μL0.3％H2O2在沙氏固體培養(yǎng)板上作用一定劑量四君子湯處理的煙曲霉菌孢子所產(chǎn)生抑菌圈直徑顯著大于無藥物處理組(P<0.05)，結(jié)果呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。說明四君子湯可以降解煙曲霉菌毒性代謝產(chǎn)物與觸酶的產(chǎn)生。

7、
　　 3 RT-PCR測定pkaCl基因的表達(dá)：四君子湯處理的孢子細(xì)胞內(nèi)pkaCl基因表達(dá)顯著低于無中藥組(P<0.05)，隨著中藥的劑量加大，孢子細(xì)胞中mRNA表達(dá)逐步下調(diào)，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。
　　 4四君子湯對感染小鼠干預(yù)效果觀察：四君子湯治療組與未服藥組相比肺組織菌落數(shù)較少，色素減弱，病理改變較輕；肺組織的煙曲霉菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，中藥治療組小鼠肺組織煙曲霉菌荷載顯著低于未治療藥組(P<0.05)。