鐵皮石斛DXS、DXR、HDR的克隆與功能分析.pdf

1、鐵皮石斛 Dendrobium officinale Kimuraet Migo是珍稀的石斛屬藥用植物之一，具有益胃生津、滋陰清熱等功效。生物堿是鐵皮石斛主要藥用成分之一，其生物堿大多屬于倍半萜類生物堿或萜類吲哚生物堿，兩類生物堿生物合成均起源于萜類途徑（MVA、MEP途徑）。1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）、1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HD

2、R）是MEP途徑中的關(guān)鍵酶，然而鐵皮石斛 DXS、DXR、HDR信息及其相關(guān)功能至今未見(jiàn)報(bào)道。本論文主要克隆了鐵皮石斛 DXS、DXR、HDR的cDNA全長(zhǎng)并進(jìn)行功能分析，旨在研究 DXS、DXR、HDR在鐵皮石斛生物堿合成途徑中的作用。主要結(jié)果如下：
　　（1）采用 RT-PCR和 RACE等方法克隆得到鐵皮石斛 DoDXS、DoDXR、DoHDR全長(zhǎng)（GenBank登錄號(hào)分別為 KF803334、KF412827、KC3448

3、27）。
　　（2）組織特異性表達(dá)分析表明，DoDXS、DoDXR、DoHDR在鐵皮石斛各個(gè)組織中都有表達(dá)；其中 DoDXS在原球莖中表達(dá)量最高，是葉的3.86倍；DoDXR在莖中表達(dá)量最高，是原球莖的2.26倍；DoHDR在葉中表達(dá)量最高，是原球莖的2.72倍。（3）通過(guò)茉莉酸甲酯（MeJA）處理后，DoDXS的表達(dá)量在12 h顯著升高，48 h達(dá)到高峰，上升5.17倍，之后下調(diào)；但 DoDXR、DoHDR卻不受 MeJA誘導(dǎo)。

4、水楊酸（SA）處理4 h后，DoDXS、DoDXR、DoHDR表達(dá)量均顯著升高，最高值分別為對(duì)照的5.46、5.25、3.36倍。脫落酸（ABA）均誘導(dǎo)DoDXS、DoDXR、DoHDR的表達(dá)量上升，峰值分別為對(duì)照的2.82、4.49、6.37倍。油菜素內(nèi)酯（BR）均誘導(dǎo) DoDXS、DoDXR、DoHDR的表達(dá)，24 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的1.59、2.27、1.26倍。
　?。?）成功構(gòu)建真核表達(dá)載體 pCambia1301

5、-DoDXS、 pCambia1301-DoDXR、pCambia1301-DoHDR。亞細(xì)胞定位分析表明 DoDXS、DoDXR、DoHDR均定位于葉綠體上。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得 DoDXS-T2代轉(zhuǎn)基因植株9個(gè)株系，且 DoDXS都獲得超表達(dá)；獲得 DoDXR-T1代擬南芥轉(zhuǎn)基因植株 DoDXR-T1代30株。
　?。?）利用 MVA和 MEP途抑制劑——洛伐他汀和膦胺霉素，研究鐵皮石斛生物堿的生物合成途徑；