根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在靈芝三萜生物合成研究中的應(yīng)用.pdf

1、靈芝（Ganoderma lucidum）是我國(guó)的傳統(tǒng)藥用真菌，具有多方面生理活性和藥理活性，但是，作為一種營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值極高的大型擔(dān)子菌，靈芝的分子生物學(xué)研究還比較少。靈芝三萜類化合物，屬于靈芝的次級(jí)代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是靈芝的主要有效成分之一?，F(xiàn)階段對(duì)于靈芝三萜生物合成的研究主要集中在通過(guò)改變發(fā)酵參數(shù)和添加誘導(dǎo)物提高靈芝三萜的產(chǎn)量，并通過(guò)克隆獲得靈芝三萜生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因以研究靈芝三萜的合成機(jī)理。但是對(duì)于靈芝三萜生物合成基因表達(dá)的

2、組織和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制方面的研究還比較少，主要原因是轉(zhuǎn)基因方法等基因工程學(xué)手段的缺乏。
　　 本文在靈芝中首次建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系，并在這一體系的基礎(chǔ)上建立了靈芝報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)及其檢測(cè)體系。首先通過(guò)根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株和靈芝原生質(zhì)體細(xì)胞的共培養(yǎng)以及潮霉素B的抗性篩選，獲得了一批具有潮霉素抗性的靈芝轉(zhuǎn)化子菌株，并通過(guò)PCR擴(kuò)增潮霉素基因（hph）片段和Southern Blot試驗(yàn)證實(shí)外源基因片段hph基

3、因片段已成功整合進(jìn)靈芝轉(zhuǎn)化子的基因組中。然后通過(guò)對(duì)各共培養(yǎng)參數(shù)的調(diào)整以進(jìn)一步優(yōu)化這一轉(zhuǎn)化方法。我們?cè)谵r(nóng)桿菌與原生質(zhì)體比例為1000∶1，添加0.2 mM乙酰丁香酮，于25℃共培養(yǎng)36小時(shí)的條件下，我們獲得了200個(gè)轉(zhuǎn)化子/105原生質(zhì)體，這一轉(zhuǎn)化效率顯著高于前期研究中電激法和REMI法的轉(zhuǎn)化效率。另外，本研究通過(guò)應(yīng)用靈芝的glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gpd)基因啟動(dòng)子、香菇的gpd基

4、因啟動(dòng)子、香菇的ras基因啟動(dòng)子和構(gòu)巢曲霉的gpd基因啟動(dòng)子帶動(dòng)抗性標(biāo)記基因，從而比較不同來(lái)源啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果顯示以靈芝gpd基因帶動(dòng)抗性標(biāo)記基因的表達(dá)載體獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率，而應(yīng)用香菇gpd和ras基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化效率相近，并高于構(gòu)巢曲霉的gpd基因啟動(dòng)子帶動(dòng)抗性標(biāo)記基因的表達(dá)載體。這一結(jié)果證明內(nèi)源啟動(dòng)子能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率。同時(shí)，本研究通過(guò)比較EGFP和GUS這兩個(gè)在植物中常用的報(bào)告基因在靈芝中的表達(dá)情況，發(fā)

5、現(xiàn)EGFP蛋白在靈芝中的表達(dá)比較弱，而GUS在靈芝中的表達(dá)效率要高于EGFP，并以GUS為報(bào)告基因建立了靈芝報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)。
　　 為研究靈芝三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(mvd)的功能和它在靈芝三萜代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用，本研究對(duì)該基因進(jìn)行了過(guò)表達(dá)研究。我們構(gòu)建了Gl-mvd過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化方法，將Gl-mvd過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入靈芝中。隨機(jī)挑取4株獲得的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子GMOEs，進(jìn)行R

6、eal-time PCR分析以考察Gl-mvd基因在mRNA水平的表達(dá)量。結(jié)果表明，GMOE9中Gl-mvd基因的表達(dá)量約為野生型菌株G20的4.5倍;其余三株GMOEs中Gl-mvd基因的表達(dá)量也均在野生型菌株G20的2.5-4.5倍。將上述挑取的GMOEs，進(jìn)行的Western Blot分析以考察Gl-mvd基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量。結(jié)果表明，這四株GMOEs中Gl-mvd基因的蛋白質(zhì)表達(dá)量相比于野生型菌株G20并無(wú)明顯提高。為深入

7、了解Gl-mvd的過(guò)表達(dá)對(duì)表型性狀的影響，我們進(jìn)一步考察了上述轉(zhuǎn)化子三萜含量的變化，結(jié)果表明，GMOE10與出發(fā)菌株G20相比，其三萜含量提高101％。其他三株過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子與G20相比，其三萜含量均有明顯的提高。對(duì)其生物量變化進(jìn)行測(cè)定顯示Gl-mvd的過(guò)表達(dá)與靈芝生物量變化并無(wú)直接關(guān)系。為了探討GMOEs中三萜含量增加的機(jī)理，我們進(jìn)一步考察了參與三萜合成的其它關(guān)鍵酶基因在GMOEs中mRNA水平的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)隨著Gl-mvd基因的過(guò)表達(dá)

8、，所考察的Gl-hmgs、Gl-hmgr、Gl-fps、Gl-sqs和Gl-osc基因的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量均有不同程度的增加。
　　 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)在啟動(dòng)子等調(diào)控元件研究中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。本研究首次將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用于靈芝基因啟動(dòng)子分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的靈芝三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶靈芝鯊烯合酶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了分析。根據(jù)前期研究得到的Gl-sqs啟動(dòng)子序列，構(gòu)建Gl-sqs啟動(dòng)子系列缺失載體。將5’缺失系列載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌

9、介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入靈芝中，并通過(guò)測(cè)定GUS酶活性對(duì)這些5，缺失啟動(dòng)子進(jìn)行活性分析。其分析結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果是比較吻合的，尤其是預(yù)測(cè)的CAAT-box等順式作用元件的缺失對(duì)啟動(dòng)子活性具有明顯下調(diào)的影響。但是，其中在對(duì)-868到-673區(qū)域進(jìn)行缺失后，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性呈現(xiàn)上升現(xiàn)象，然而在對(duì)該區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí)并未預(yù)測(cè)出該區(qū)域存在抑制啟動(dòng)子活性的順式作用元件。對(duì)該區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的50 bp缺失分析顯示，對(duì)-822到-776和-7

10、75到-721兩個(gè)區(qū)域的缺失，則使啟動(dòng)子活性大幅度上升，表明該區(qū)域存在有能夠顯著降低啟動(dòng)子活性的結(jié)構(gòu)。另外，在實(shí)驗(yàn)室的前期研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MeJA對(duì)靈芝三萜生物合成具有顯著的誘導(dǎo)作用，同時(shí)能夠顯著提高sqs基因的表達(dá)水平。在對(duì)靈芝sqs基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在靈芝sqs基因啟動(dòng)子上存在有3個(gè)潛在的MeJA響應(yīng)元件作用位點(diǎn)。通過(guò)應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，我們對(duì)這三個(gè)潛在的MeJA響應(yīng)元件進(jìn)行了缺失和突變分析。結(jié)果顯示位于啟動(dòng)子上