根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在靈芝三萜生物合成研究中的應(yīng)用.pdf

1、靈芝（Ganoderma lucidum）是我國的傳統(tǒng)藥用真菌，具有多方面生理活性和藥理活性，但是，作為一種營養(yǎng)和保健價值極高的大型擔(dān)子菌，靈芝的分子生物學(xué)研究還比較少。靈芝三萜類化合物，屬于靈芝的次級代謝產(chǎn)物，被認為是靈芝的主要有效成分之一?，F(xiàn)階段對于靈芝三萜生物合成的研究主要集中在通過改變發(fā)酵參數(shù)和添加誘導(dǎo)物提高靈芝三萜的產(chǎn)量，并通過克隆獲得靈芝三萜生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因以研究靈芝三萜的合成機理。但是對于靈芝三萜生物合成基因表達的

2、組織和發(fā)育的調(diào)控機制方面的研究還比較少，主要原因是轉(zhuǎn)基因方法等基因工程學(xué)手段的缺乏。
　　 本文在靈芝中首次建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系，并在這一體系的基礎(chǔ)上建立了靈芝報告基因表達系統(tǒng)及其檢測體系。首先通過根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株和靈芝原生質(zhì)體細胞的共培養(yǎng)以及潮霉素B的抗性篩選，獲得了一批具有潮霉素抗性的靈芝轉(zhuǎn)化子菌株，并通過PCR擴增潮霉素基因（hph）片段和Southern Blot試驗證實外源基因片段hph基

3、因片段已成功整合進靈芝轉(zhuǎn)化子的基因組中。然后通過對各共培養(yǎng)參數(shù)的調(diào)整以進一步優(yōu)化這一轉(zhuǎn)化方法。我們在農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體比例為1000∶1，添加0.2 mM乙酰丁香酮，于25℃共培養(yǎng)36小時的條件下，我們獲得了200個轉(zhuǎn)化子/105原生質(zhì)體，這一轉(zhuǎn)化效率顯著高于前期研究中電激法和REMI法的轉(zhuǎn)化效率。另外，本研究通過應(yīng)用靈芝的glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gpd)基因啟動子、香菇的gpd基

4、因啟動子、香菇的ras基因啟動子和構(gòu)巢曲霉的gpd基因啟動子帶動抗性標(biāo)記基因，從而比較不同來源啟動子對轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果顯示以靈芝gpd基因帶動抗性標(biāo)記基因的表達載體獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率，而應(yīng)用香菇gpd和ras基因啟動子的表達載體的轉(zhuǎn)化效率相近，并高于構(gòu)巢曲霉的gpd基因啟動子帶動抗性標(biāo)記基因的表達載體。這一結(jié)果證明內(nèi)源啟動子能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率。同時，本研究通過比較EGFP和GUS這兩個在植物中常用的報告基因在靈芝中的表達情況，發(fā)

5、現(xiàn)EGFP蛋白在靈芝中的表達比較弱，而GUS在靈芝中的表達效率要高于EGFP，并以GUS為報告基因建立了靈芝報告基因表達系統(tǒng)。
　　 為研究靈芝三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(mvd)的功能和它在靈芝三萜代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用，本研究對該基因進行了過表達研究。我們構(gòu)建了Gl-mvd過表達載體，并通過應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化方法，將Gl-mvd過表達載體轉(zhuǎn)入靈芝中。隨機挑取4株獲得的過表達轉(zhuǎn)化子GMOEs，進行R

6、eal-time PCR分析以考察Gl-mvd基因在mRNA水平的表達量。結(jié)果表明，GMOE9中Gl-mvd基因的表達量約為野生型菌株G20的4.5倍;其余三株GMOEs中Gl-mvd基因的表達量也均在野生型菌株G20的2.5-4.5倍。將上述挑取的GMOEs，進行的Western Blot分析以考察Gl-mvd基因在蛋白質(zhì)水平的表達量。結(jié)果表明，這四株GMOEs中Gl-mvd基因的蛋白質(zhì)表達量相比于野生型菌株G20并無明顯提高。為深入

7、了解Gl-mvd的過表達對表型性狀的影響，我們進一步考察了上述轉(zhuǎn)化子三萜含量的變化，結(jié)果表明，GMOE10與出發(fā)菌株G20相比，其三萜含量提高101％。其他三株過表達轉(zhuǎn)化子與G20相比，其三萜含量均有明顯的提高。對其生物量變化進行測定顯示Gl-mvd的過表達與靈芝生物量變化并無直接關(guān)系。為了探討GMOEs中三萜含量增加的機理，我們進一步考察了參與三萜合成的其它關(guān)鍵酶基因在GMOEs中mRNA水平的表達量。發(fā)現(xiàn)隨著Gl-mvd基因的過表達

8、，所考察的Gl-hmgs、Gl-hmgr、Gl-fps、Gl-sqs和Gl-osc基因的轉(zhuǎn)錄水平的表達量均有不同程度的增加。
　　 瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在啟動子等調(diào)控元件研究中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。本研究首次將瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用于靈芝基因啟動子分析，對實驗室前期獲得的靈芝三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶靈芝鯊烯合酶基因的啟動子進行了分析。根據(jù)前期研究得到的Gl-sqs啟動子序列，構(gòu)建Gl-sqs啟動子系列缺失載體。將5’缺失系列載體通過根癌農(nóng)桿菌

9、介導(dǎo)的靈芝轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入靈芝中，并通過測定GUS酶活性對這些5，缺失啟動子進行活性分析。其分析結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果是比較吻合的，尤其是預(yù)測的CAAT-box等順式作用元件的缺失對啟動子活性具有明顯下調(diào)的影響。但是，其中在對-868到-673區(qū)域進行缺失后，發(fā)現(xiàn)啟動子活性呈現(xiàn)上升現(xiàn)象，然而在對該區(qū)域進行生物信息學(xué)分析時并未預(yù)測出該區(qū)域存在抑制啟動子活性的順式作用元件。對該區(qū)域進行進一步的50 bp缺失分析顯示，對-822到-776和-7

10、75到-721兩個區(qū)域的缺失，則使啟動子活性大幅度上升，表明該區(qū)域存在有能夠顯著降低啟動子活性的結(jié)構(gòu)。另外，在實驗室的前期研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MeJA對靈芝三萜生物合成具有顯著的誘導(dǎo)作用，同時能夠顯著提高sqs基因的表達水平。在對靈芝sqs基因啟動子的生物信息學(xué)分析時，我們發(fā)現(xiàn)在靈芝sqs基因啟動子上存在有3個潛在的MeJA響應(yīng)元件作用位點。通過應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，我們對這三個潛在的MeJA響應(yīng)元件進行了缺失和突變分析。結(jié)果顯示位于啟動子上