蜂王漿酶解產(chǎn)物的理化特性、生物學(xué)活性及其作用機(jī)理研究.pdf

1、蜂王漿是哺育蜂咽下腺和上顎腺分泌的，用以飼喂蜂王和1～3日齡幼蟲的漿狀物質(zhì)。蜂王漿富含蛋白質(zhì)，且具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗腫瘤和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等多種生物學(xué)功能。我國是世界第一蜂王漿生產(chǎn)國和輸出國，但長期以來，受到蜂王漿本身辛辣口感、漿狀質(zhì)地和溶解性欠佳等理化特性的局限和研究水平、加工技術(shù)的限制，我國出口和銷售的大部分蜂王漿產(chǎn)品均為初級加工或原料產(chǎn)品。這在很大程度上制約了蜂王漿的市場空間和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，滯緩了蜂王漿推廣應(yīng)用的速度。

2、因此，采用一些技術(shù)手段對蜂王漿進(jìn)行改造顯得尤為重要。
　　 水解技術(shù)是蛋白類材料改性的一種有效手段。經(jīng)過水解改性所得的產(chǎn)物往往比原料蛋白具有更優(yōu)異的理化特性、營養(yǎng)特性和生物學(xué)活性，能夠更好地滿足相關(guān)行業(yè)的需要。目前，一些植物蛋白（如大豆）、動(dòng)物蛋白（如魚蝦）及微生物蛋白（如酵母）的水解產(chǎn)物已經(jīng)得到開發(fā)和利用，成為新型的工業(yè)原材料和農(nóng)業(yè)新能源。
　　 本研究從酶解的角度入手，對蜂王漿酶解產(chǎn)物的理化特性和生物學(xué)活性進(jìn)行了詳細(xì)

3、分析，并探討了酶解工藝與產(chǎn)物特性的相關(guān)性。理化特性部分首次界定了蜂王漿酶解產(chǎn)物的色度和粘度特性。酶解工藝部分，通過單因素分析和正交分析，探尋了各酶解條件對于產(chǎn)物抗氧化性的影響次序和影響力，為明確產(chǎn)物抗氧化性與酶解工藝條件的相關(guān)性提供理論依據(jù)，并獲取了具有優(yōu)異抗氧化性能的蜂王漿酶解優(yōu)化產(chǎn)物。隨后，通過構(gòu)建D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型，首次全面衡量了蜂王漿酶解產(chǎn)物在該模型條件下的體內(nèi)抗衰老活性。最后，還結(jié)合細(xì)胞模型對蜂王漿酶解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)

4、作用進(jìn)行了分析。研究結(jié)果如下:
　　 (1)蜂王漿在經(jīng)過酶解后，其粗蛋白含量和蛋白回收率能維持較高水平，氨基酸種類豐富、含量高。酶解產(chǎn)物的相對分子量顯著下降，粘度下降，表現(xiàn)出良好的流動(dòng)性。此外，酶解還改變了蜂王漿的色澤，酶解產(chǎn)物水溶液的通透性相比蜂王漿顯著提高。
　　 (2)采用2，2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)法和鐵離子還原抗氧化能力（FRAP）法測定蜂王漿酶解優(yōu)化產(chǎn)物的體外抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶解能夠顯著改變

5、蜂王漿的體外抗氧化活性，優(yōu)化的蜂王漿酶解產(chǎn)物具有顯著高于蜂王漿本身的抗氧化活性。單因素試驗(yàn)測定結(jié)果表明，酶解工藝條件的改變會(huì)影響蜂王漿酶解產(chǎn)物清除DPPH的活性和還原鐵離子的能力。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，酶解工藝條件對酶解產(chǎn)物清除DPPH的影響次序?yàn)?酶解時(shí)間＞底物濃度＞酶與底物濃度比＞pH;對酶解產(chǎn)物還原力的影響的次序?yàn)?底物濃度＞pH＞酶解時(shí)間＞酶與底物濃度比。綜合各因素影響主次及影響力大小，最終獲得的最佳酶解工藝為:在pH8.0條件下，

6、加入胰蛋白酶對蜂王漿進(jìn)行酶解，選擇酶與底物濃度比為1.5％，控制底物濃度為125 g kg-1，以45℃恒溫磁力攪拌酶解4h。
　　 (3)通過構(gòu)建D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型，首次檢測了優(yōu)化的蜂王漿酶解產(chǎn)物對于該類衰老模型小鼠的外部衰老表征和內(nèi)部衰老表征的改善作用，全面衡量了蜂王漿酶解產(chǎn)物的體內(nèi)抗衰老活性。結(jié)果表明，在改善外部衰老方面，低劑量的蜂王漿酶解優(yōu)化產(chǎn)物能夠干預(yù)D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠體重下降的狀況。高低劑量的蜂王漿酶解優(yōu)

7、化產(chǎn)物均能改善抗衰老小鼠活動(dòng)能力下降的情況。與此同時(shí)，蜂王漿酶解優(yōu)化產(chǎn)物還能夠提高小鼠非空間性長期學(xué)習(xí)記憶能力和空間性長期學(xué)習(xí)記憶能力，使之保持良好的記憶力、對空間和方位的快速判斷力以及對學(xué)習(xí)和訓(xùn)練結(jié)果的長期鞏固能力，具有優(yōu)異的回避危害的學(xué)習(xí)能力及長期記憶能力。在改善內(nèi)部衰老方面，蜂王漿酶解優(yōu)化產(chǎn)物能廷緩胸腺等器官的萎縮，表現(xiàn)出對器官衰老的抑制作用。蜂王漿酶解優(yōu)化產(chǎn)物還能夠提高小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、提高小鼠肝臟過氧化氫酶

8、(CAT)的活力、提高小鼠肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)的活力并抑制小鼠腦中丙二醛(MDA)的積累，高劑量效果等同或顯著優(yōu)于蜂王漿。
　　 (4)采用刀豆蛋白A(ConA)刺激小鼠脾臟T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，用脂多糖(LPS)刺激小鼠脾臟B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以四甲基戊唑藍(lán)(MTT)法檢測蜂王漿酶解產(chǎn)物對于衰老小鼠脾T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。同時(shí)，采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定蜂王漿酶解產(chǎn)物對于自然殺傷細(xì)胞(NK)活力的影響，研究了蜂王

9、漿酶解產(chǎn)物對于免疫調(diào)節(jié)的作用。并進(jìn)一步從NF-κB信號通路的角度評價(jià)蜂王漿及其優(yōu)化的酶解產(chǎn)物對于LPS刺激下小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比衰老小鼠，低劑量的蜂王漿優(yōu)化酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出對LPS刺激下小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的顯著促進(jìn)作用。高劑量效果更佳，與蜂王漿相比達(dá)到顯著差異。優(yōu)化的蜂王漿酶解產(chǎn)物還能部分抑制NF-κB抑制蛋白(IκBα)的降解。而對于ConA刺激下小鼠脾臟T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和NK細(xì)胞活性影響，給予