蜂王漿的酶法修飾及其ACE抑制活性和抗氧化活性研究.pdf

1、本論文以鮮蜂王漿為原料，用工業(yè)化生產(chǎn)的微生物來(lái)源的蛋白酶進(jìn)行適度酶解修飾，并對(duì)其產(chǎn)物的組成、分子量大小以及氨基酸組成、序列和生理活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探索酶法修飾產(chǎn)物的組成和結(jié)構(gòu)與生理活性之間的關(guān)系，為進(jìn)一步以易于獲得的蛋白酶對(duì)蜂王漿進(jìn)行酶法修飾生產(chǎn)高活性的蜂王漿產(chǎn)品提供一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。主要研究?jī)?nèi)容和試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)蜂王漿酶法修飾用蛋白酶的選擇：以抑制ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)活性為指標(biāo)，在蜂王漿質(zhì)量濃度為0.05

2、 g/mL(濕重)時(shí)，比較五種工業(yè)化生產(chǎn)的微生物來(lái)源蛋白酶酶法修飾產(chǎn)物和新鮮蜂王漿對(duì)ACE的抑制活性，結(jié)果表明新鮮蜂王漿對(duì)ACE的抑制率僅為6.45±0.84%，而5種蛋白酶酶法修飾產(chǎn)物皆有很強(qiáng)的抑制活性，其中天野蛋白酶P的酶法修飾產(chǎn)物的抑制ACE酶活性最強(qiáng)，其抑制率達(dá)到71.47±2.86%，因此選取天野蛋白酶P對(duì)蜂王漿進(jìn)行適度酶法修飾，確定最佳的酶法修飾條件。
　　 (2)酶法修飾工藝條件的優(yōu)化：以酶解時(shí)間、蜂王漿質(zhì)量濃度、

3、蛋白酶添加量為單因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)響應(yīng)面分析得到天野蛋白酶P最佳酶解修飾條件為：酶解時(shí)間196min、蜂王漿質(zhì)量濃度0.0653g/mL(濕重)，加酶量1503u/g。
　　 (3)酶法修飾產(chǎn)物的分離條件優(yōu)化：在天野蛋白酶P的最佳酶法修飾條件下對(duì)蜂王漿進(jìn)行酶解修飾，其產(chǎn)物用葡聚糖凝膠G-25進(jìn)行分離，最佳的洗脫條件為：Imol/L醋酸為流動(dòng)相，上樣

4、量1.5mL，流速為0.8mL/min，共分離出三個(gè)色譜峰，收集各洗脫峰，濃縮凍干，分別命名為GFC-1、GFC-2和GFC-3。
　　 (4)蜂王漿、酶解產(chǎn)物以及凝膠色譜分離各級(jí)分對(duì)ACE酶抑制活性的比較：新鮮蜂王漿幾乎沒(méi)有抑制ACE活性，而蜂王漿經(jīng)過(guò)酶法修飾后的酶解產(chǎn)物對(duì)ACE抑制活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)。當(dāng)濃度為4.5 mg/mL(干重)時(shí)，新鮮蜂王漿ACE抑制率僅為5.45±1.67%，蜂王漿經(jīng)過(guò)天野蛋白酶P酶法修飾

5、后的酶解產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到48.19±1.98%，GFC-3的抑制率最高，達(dá)到72.75±2.12%。酶解產(chǎn)物及其經(jīng)過(guò)凝膠色譜分離得到的各級(jí)分的ACE抑制活性存在明顯差異，GFC-3的ACE抑制活性最強(qiáng)(P<0.05)，IC50為3.193 mg/mL。
　　 (5)酶解產(chǎn)物以及凝膠色譜分離各級(jí)分與蜂王漿抗氧化活性比較：
　　 ①硫代巴比妥酸法測(cè)定樣品對(duì)脂質(zhì)體系過(guò)氧化的抑制能力(%)：在3.8mg/mL時(shí)，新鮮蜂王漿

6、的抑制率僅為12.69±0.28%，酶解產(chǎn)物及各級(jí)分抑制率顯著增強(qiáng)(P<0.01)，其中酶解產(chǎn)物的抑制率為64.7±1.16%，GFC-3的抑制率最高，達(dá)到74.73±2.25%。不同濃度條件下，GFC-3的抑制率最高(P<0.01)，其IC50為3.382mg/mL。
　　 ②鄰苯三酚法測(cè)定樣品對(duì)超氧陰離子的清除率(%)：在2.4mg/mL時(shí)，新鮮蜂王漿的清除率僅為11.38±1.07%，酶解產(chǎn)物和各級(jí)分的清除率顯著增加(P<

7、0.01)，其中酶解產(chǎn)物清除率達(dá)到63.07±0.7%，GFC-3的清除率最高為72.38±0.68%。不同濃度條件下，GFC-3的清除率最高(P<0.01)，其IC50為1.626mg/mL。
　　 ③Fenton體系法測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的清除率(%)：在5.6mg/mL時(shí)，新鮮蜂王漿對(duì)羥自由基清除率僅為11.16±1.57%，酶解產(chǎn)物和各級(jí)分的清除率有了顯著的增強(qiáng)(P<0.01)，其中酶解產(chǎn)物的清除率達(dá)到63.04±1.14

8、%，GFC-3的清除率最高，為70.16±1.44%。不同濃度條件下，GFC-3的清除率最高(P<0.01)，其IC50為4mg/mL。
　　 ④樣品對(duì)Fe3+還原能力的比較：分別比較了新鮮蜂王漿、蜂王漿酶法修飾產(chǎn)物及其凝膠色譜分離產(chǎn)物對(duì)Fe3+還原能力。當(dāng)濃度為9mg/mL時(shí)新鮮蜂王漿還原Fe3+為Fe2+能力值A(chǔ)700nm為0.127±0.008，酶解產(chǎn)物和各級(jí)分還原Fe3+為Fe2+能力顯著增加(P<0.01)，酶解產(chǎn)物還

9、原Fe3+為Fe2+能力值A(chǔ)700nm為0.63±0.009，GFC-3還原Fe3+為Fe2+能力最強(qiáng)，其A700nm達(dá)到0.74±0.006。不同濃度條件下，GFC-3還原能力最強(qiáng)(P<0.01)。以A700nm為0.5時(shí)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察各成分的還原能力，GFC-3的濃度為7.126mg/mL。
　　 (6)GFC-3的氨基酸組成分析及MALDI-TOF-MS分析表征：對(duì)活性最強(qiáng)的GFC-3進(jìn)行氨基酸組成分析，發(fā)現(xiàn)其含有17種