金黃色葡萄球菌SaeRS對重要毒力基因的分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌有一套復(fù)雜的調(diào)節(jié)毒力因子協(xié)調(diào)表達(dá)的全局調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中SaeRS(Staphylococcus aureus exoprotein expression)雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Twocomponent regulatory systems，TCRSs)是最重要的調(diào)節(jié)因子之一。SaeRS雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)由反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR和組氨酸激酶蛋白SaeS組成。較多的研究表明SaeRS雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)處于調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的下游位置，在

2、調(diào)節(jié)毒力的通路中起到關(guān)鍵的作用。而關(guān)于SaeRS雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)是如何對毒力因子進(jìn)行調(diào)節(jié)的分子機(jī)制目前還不是很明確。因此，我們純化了SaeRS雙組份系統(tǒng)中的效應(yīng)分子SaeR蛋白，通過EMSA實(shí)驗(yàn)分析可能受SaeRS直接調(diào)控的毒力基因，對SaeRS調(diào)控重要毒力基因的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　方法：
　　用PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌SA75 saeR基因的全長，克隆于原核表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-sa

3、eR。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中，用終濃度為0.4mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。設(shè)計(jì)溫度梯度（25℃，30℃及37℃），收集菌體后進(jìn)行SDS-PAGE分析。確定條件后，以anti-HisTag為一抗，用WesternBlot方法進(jìn)行重組蛋白鑒定。將二次活化后的BL21-pET28a-saeR菌液按1∶200比例接種在1000mL的卡那霉素陽性(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，加入終濃度為0.4mM的IP

4、TG，置于25℃培養(yǎng)12h，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白HisSaeR。收集過夜的誘導(dǎo)菌體，用結(jié)合緩沖液重懸，經(jīng)超聲破碎后取總蛋白上清液，利用金屬螯合親和層析法分離純化重組蛋白HisSaeR。將純化的重組蛋白HisSaeR經(jīng)腹腔免疫Balb/c小鼠，分別在初次免疫3周及加強(qiáng)免疫2周及6周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液，收集抗SaeR多克隆抗體。用間接ELISA法檢測抗體效價(jià)并進(jìn)行特異性檢測。利用制備的抗SaeR多克隆抗體，用Western Blot法對我們

5、課題組前期構(gòu)建的saeRS敲除突變菌株（SA75-ΔsaeRS）進(jìn)行驗(yàn)證并檢測不同生長時(shí)期(3h、6h、9h)SA75 SaeR蛋白的表達(dá)水平。用RT-PCR方法檢測SA75及SA75-ΔsaeRS突變株saeR、hla、luk-PV、coa、fnbB、sak、psmβ基因表達(dá)水平。最后利用凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)分析純化蛋白SaeR和這些毒力基因啟動區(qū)序列的結(jié)合能力。
　　結(jié)果：
　　將兩端添加了酶切位點(diǎn)的saeR全長基因的PCR

6、產(chǎn)物(687bp)，與經(jīng)雙酶切的pET28a質(zhì)粒連接，經(jīng)酶切、PCR及基因測序進(jìn)行驗(yàn)證，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌株BL21中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體進(jìn)行超聲裂解，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，在約29kDa的位置有一明顯的條帶，而空載菌株未見該條帶，而且尤以0.4mM IPTG、25℃、誘導(dǎo)12h的條件下重組蛋白的表達(dá)量最高。隨后對該條帶用Western Blot法進(jìn)行驗(yàn)證，重組表達(dá)菌株B

7、L21-pET28a-saeR出現(xiàn)信號，而陰性對照未出現(xiàn)。將含HisSaeR的總蛋白上清液過鎳親和層析柱，分離純化重組蛋白HisSaeR，獲得了較單一的條帶。經(jīng)Western Blot驗(yàn)證制備的抗SaeR多克隆抗體能和SaeR蛋白特異結(jié)合。ELISA法檢測的抗SaeR多克隆抗體效價(jià)可達(dá)215。SA75野生株在不同生長時(shí)期(3h、6h、9h)均可檢測到SaeR條帶信號，而saeRS敲除株未檢測到信號。SA75的saeRS基因轉(zhuǎn)錄水平在對數(shù)

8、生長中期(3h)處于峰值（約為6h的9倍），在對數(shù)生長晚期(6h)明顯下降，而進(jìn)入平臺期后(9h)轉(zhuǎn)錄水平有所升高（約為6h的2倍左右）。與野生株相比，ΔsaeRS突變株pvl基因轉(zhuǎn)錄水平在3h、6h、9h分別下調(diào)約20倍、6倍、6倍;hla基因幾乎無轉(zhuǎn)錄;coa基因轉(zhuǎn)錄水平在各時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)3倍;fnbB基因轉(zhuǎn)錄水平在3h下調(diào)30倍，在6h下調(diào)3倍;psmβ基因和sak基因轉(zhuǎn)錄水平無變化。將純化蛋白SaeR和pvl、hla、fnnB、c

9、oa及其自身P1啟動子在體外進(jìn)行EMSA，均可看到阻滯的條帶。
　　結(jié)論：
　　1.成功表達(dá)了金黃色葡萄球菌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR和制備了抗SaeR多克隆抗體。
　　2.金黃色葡萄球菌SaeRS雙組份正調(diào)控fnbB, coa, hla和pvl基因的表達(dá)，對sak、psmβ基因無調(diào)控作用。
　　3.金黃色葡萄球菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對fnbB, coa, hla和pvl基因表達(dá)的正調(diào)控作用是通過SaeR蛋白與這些