金黃色葡萄球菌腸毒素C2His118定點突變研究.pdf

1、超抗原(Superantigen，SAg)是一類具有多種免疫活性的蛋白分子，能大量激活T細胞。與普通抗原不同，超抗原無需抗原提呈細胞的加工處理，以完整蛋白形式結合于MIHCII(MajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules，MHCII)類分子結合槽的外側及T細胞表面TCRVβ(VariablepactsoftheTcellreceptor,TCRVβ)區(qū)。微量超抗原即可產生大量有生物學活性

2、的細胞因子和藥性效應，引發(fā)超級抗原依賴的細胞介導的細胞毒性作用(Superantigendependcntcell-mediatedcytotoxicity,SDCC)和其它免疫效應，從而可在體內抑制腫瘤細胞生長。StaphylococcusenterotoxinC2(SEC2)作為由金黃色葡萄球菌產生的超抗原，在臨床已被用于肺癌、食道癌、卵巢癌、晚期肝癌、大腸癌、血癌、膀胱癌等惡性腫瘤的治療，效果極為顯著。但作為潛在的腸胃毒素，SEC

3、2會引起嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴重限制了其在腫瘤治療中的應用。 腸毒素分子結構與其致病性、致病能力關系密切，腸毒素所引發(fā)的催吐效應和T細胞誘導效應無關，而與His118有關。本研究利用PCR介導的定點突變技術，對sec2基因中的His118密碼子實行定點突變，獲得突變體蛋白。通過刺激鼠脾淋巴細胞增殖和胰酶穩(wěn)定性研究，分析突變體蛋白的超抗原活性及胰酶穩(wěn)定性。通過對人大腸癌細胞CX-1抑瘤研究，確認突變體抑瘤效果。本研究結果如下：

4、 應用MutanBESTKit試劑盒，以pET-28a-SEC2為模板進行PCR擴增，獲得SEC2突變體表達質粒：pET-28a-SEC2(H118Y)。SEC2突變基因在大腸桿菌中經IPTG誘導，實現高效表達。經Ni-NTA親和層析柱和SephadexG-75純化，獲得高純度的突變體蛋白。 在胰蛋白酶與突變體蛋白的質量比在1:200的條件下，觀察突變體蛋白胰酶穩(wěn)定性。SDS-PAGE結果表明，突變體蛋白SEC2(H118Y)