特發(fā)性和心臟損傷后縮窄性心包炎的纖維鈣化機(jī)制研究.pdf

1、目的：近年來(lái)，特發(fā)性和心臟損傷后縮窄性心包炎（Idiopathic and post-cardiac-injuryconstrictive pericarditis, IAPCP）的發(fā)病率逐年上升，已成為心包疾病防治領(lǐng)域中一個(gè)亟待解決的重要問(wèn)題，也是影響心臟手術(shù)病人生存質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵因素。最新研究進(jìn)展表明心包纖維鈣化是IAPCP 產(chǎn)生心包縮窄癥狀的主要原因，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床上無(wú)有效藥物和非手術(shù)干預(yù)方法。因而，我們以此為切

2、入點(diǎn)，從基因、細(xì)胞及組織三個(gè)不同的層面深入探索IAPCP 心包纖維鈣化的發(fā)病機(jī)制、初步嘗試針對(duì)性的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，旨在為今后IAPCP的臨床防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 方法：為以上目的，本研究分為以下六部分。1. IAPCP 心包的分子病理研究：收集上海長(zhǎng)海醫(yī)院資料完整、臨床病理診斷明確的IAPCP 心包標(biāo)本共45例，其中特發(fā)性心包炎（Idiopathic constrictive pericarditis, ICP）43例，

3、心臟損傷后心包炎（Post-cardiac-injury constrictive pericarditis, PCP）2例。所有IAPCP 病例均有石蠟包埋組織，其中18例ICP 有新鮮標(biāo)本、液氮保存。正常對(duì)照心包12例，均為液氮保存的新鮮標(biāo)本。采用蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin and Eosin, HE）觀察IAPCP 心包的組織學(xué)特征、維多利亞藍(lán)-苦味酸酸性復(fù)紅染色（Victoria blue-van Gieson,

4、VG）確定纖維化程度、Von Kossa 染色檢測(cè)心包內(nèi)鈣鹽沉積情況。采用免疫組織化學(xué)和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（Termin Aldeoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL）染色確定IAPCP的心包間質(zhì)細(xì)胞（PericardiAlinterstitiAlcells, PICs）表型的改變和凋亡的發(fā)生。抽

5、提新鮮組織標(biāo)本的總RNA，qRT-PCR分析細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的改變。2. TGF-β1在IAPCP 心包中的表達(dá)及對(duì)PICs的作用：采用western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1, TGF-β1）在IAPCP 心包中的表達(dá)豐度及細(xì)胞定位。分離培養(yǎng)正常對(duì)照心包的PICs，并給予TGF-β1因子；采用qRT-PCR分析TGF-β1處理前后PICs細(xì)胞外基

6、質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的改變；明膠酶酶譜法檢測(cè)明膠酶活性的改變；動(dòng)態(tài)觀察TGF-β1誘導(dǎo)融合的PICs 形成鈣化結(jié)節(jié)的過(guò)程；免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL 染色、Von Kossa 染色確定PICs表型的改變、凋亡及鈣鹽沉積情況；流式細(xì)胞儀和比色法定量凋亡率和鈣沉積程度。3. FGF-2、PDGF、BMP-2在IAPCP 心包中的表達(dá)及對(duì)PICs的作用：采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)成纖維生長(zhǎng)因子-2 （Fibroblast growth factor

7、-2, FGF-2）、血小板源性生長(zhǎng)因子（Platelet-derived growthfactor, PDGF）和骨形成蛋白-2 （Bone morphogenetic protein-2, BMP-2）在IAPCP 心包中的表達(dá)；分離培養(yǎng)PICs，分別給予FGF-2、PDGF-AA、BMP-2 因子后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析PICs表型的改變。4.自體心包瓣置換主動(dòng)脈瓣：再次手術(shù)心包瓣的病理分析：對(duì)本科室所完成的15例自體心包瓣置

8、換主動(dòng)脈瓣手術(shù)病人行長(zhǎng)期隨訪；收集再次手術(shù)標(biāo)本，采用HE、VG和免疫組織化學(xué)染色觀察自體心包瓣的病理組織學(xué)改變、檢測(cè)PICs的表型。5.PICs的生物學(xué)特征研究：分離培養(yǎng)PICs和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymAlstem cells, MSCs）。觀察PICs的形態(tài)和生長(zhǎng)特征，β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)各代細(xì)胞中的衰老細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析PICs的免疫表型，特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)PICs 向骨母、軟骨母細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，通過(guò)免疫組織化學(xué)

9、、免疫細(xì)胞化學(xué)及油紅O 染色分析PICs的分化能力。MTT 法測(cè)定PICs和MSCs的細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀分析兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。通過(guò)觀察成纖維細(xì)胞集落形成單位（Fibroblastic colony-forming unit, CFU-f）確定兩種細(xì)胞的自我更新能力；采用RT-PCR 方法比較兩種細(xì)胞表達(dá)自我更新相關(guān)基因的差異。6.Klf4逆轉(zhuǎn)心包肌纖維母細(xì)胞至PICs的研究：分離培養(yǎng)IAPCP的心包肌纖維母細(xì)胞，采用流式細(xì)胞

10、儀、β-半乳糖苷酶染色、原位凋亡染色等方法觀察肌纖維母細(xì)胞的生物學(xué)特征。給予Krüppel樣因子4 腺病毒（Adenovir AlKrüppel-like factor 4, AdKlf4）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺病毒（Adenovir Alenhanced green fluorescent protein, AdEGFP），熒光顯微鏡下觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)確定細(xì)胞感染效率，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、β-半乳糖苷酶

11、染色、western blot、RT-PCR 確定Klf4逆轉(zhuǎn)心包肌纖維母細(xì)胞表型及降低膠原合成的能力，同時(shí)確定Klf4 減少細(xì)胞衰老、阻止衰老基因表達(dá)的可行性。
　　 結(jié)果：1.IAPCP心包的分子病理研究：HE和VG染色顯示纖維化和鈣化是IAPCP心包的主要病理改變，其中5例鈣化心包見(jiàn)骨化區(qū)域。免疫組織化學(xué)染色表明IAPCP心包的PICs異常轉(zhuǎn)分化，表達(dá)肌纖維母細(xì)胞表型標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-Smoothmuscle

12、actin,α-SMA）和骨母細(xì)胞表型標(biāo)記物堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）；3例無(wú)鈣化心包亦檢測(cè)到ALP陽(yáng)性細(xì)胞，心包鈣化程度與PICs骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化率成正相關(guān)（rs=0.7579,P<0.05）。TUNEL染色表明隨著鈣化程度的升高，凋亡率逐漸增多，心包鈣化程度與PICs的凋亡率成正相關(guān)（rs=0.4826,P<0.05）。qRT-PCR表明ICP心包中I型膠原和III型膠原的轉(zhuǎn)錄水平、金屬基質(zhì)蛋白酶-

13、2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）/金屬基質(zhì)蛋白酶抑制物-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2）和MMP-9/TIMP-1的比率明顯高于正常對(duì)照心包，彈力蛋白的轉(zhuǎn)錄水平、MMP-1/TIMP-1和MMP-13/TIMP-1的比率降低（所有P<0.05）。2.TGF-β1在IAPCP心包中的表達(dá)及對(duì)PICs的作用：IAPCP心包表達(dá)TGF-β1

14、蛋白，其蛋白豐度與膠原/彈力比率（r=0.6585,P<0.05）和心包鈣化程度（rs=0.5328,P<0.05）呈正相關(guān)。細(xì)胞特異性免疫組織染色證實(shí)TGF-β1及其受體主要表達(dá)于PICs，提示TGF-β1以自-旁分泌的形式作用于PICs。體外模型證實(shí)TGF-β1促進(jìn)PICs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；在誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的同時(shí)，TGF-β1還上調(diào)細(xì)胞中I型膠原、III型膠原、MMP-2、MMP-8、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的轉(zhuǎn)錄

15、水平，并下調(diào)MMP-1和MMP-13的表達(dá)（所有P<0.05）。明膠酶酶譜法表明TGF-β1處理組的細(xì)胞上清中存在MMP-9和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的異源二聚體。給予TGF-β1，融合的PICs能自發(fā)性收縮、聚集生長(zhǎng)、形成結(jié)節(jié)、表達(dá)ALP蛋白，在形成的結(jié)節(jié)中部分細(xì)胞凋亡壞死。與未處理的細(xì)胞相比，TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞結(jié)節(jié)表達(dá)較高的

16、ALP活性、含有更多的鈣鹽和凋亡細(xì)胞（所有P<0.05）。3.FGF-2、PDGF、BMP-2在IAPCP心包中的表達(dá)及對(duì)PICs的作用：免疫組織化學(xué)染色證實(shí)IAPCP心包表達(dá)FGF-2、PDGF和BMP-2蛋白，體外實(shí)驗(yàn)表明FGF-2、PDGF-AA和BMP-2均能誘導(dǎo)PICs表達(dá)α-SMA，而且BMP-2還能誘導(dǎo)PICs表達(dá)ALP。4.自體心包瓣置換主動(dòng)脈瓣：再次手術(shù)心包瓣的病理分析：隨訪結(jié)束時(shí)，瓣膜交界撕裂、心內(nèi)膜炎、瓣膜退行性變

17、（纖維化和/或鈣化）、再次手術(shù)的免除率分別為100％、93％、80％和67％，瓣膜相關(guān)的死亡率為0％。手術(shù)切除的自體心包瓣均行病理分析，結(jié)果表明自體心包瓣在宿主體內(nèi)5個(gè)月就被覆VIII因子陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮下細(xì)胞表達(dá)α-SMA，HE和VG染色表明該瓣膜無(wú)明顯纖維化。因纖維鈣化而衰敗的心包瓣（n=3）中的PICs表達(dá)α-SMA，部分細(xì)胞表達(dá)ALP；VG染色顯示心包瓣的心室面有一層彈力板，這種彈力板見(jiàn)于主動(dòng)脈瓣，但是正常心包和早期手術(shù)的心

18、包瓣中沒(méi)有。5.PICs的生物學(xué)特征研究：體外培養(yǎng)的PICs呈成纖維細(xì)胞樣外觀，在傳代過(guò)程中，細(xì)胞體積逐漸增大、變寬，衰老細(xì)胞增多，并逐漸表達(dá)α-SMA。細(xì)胞周期檢測(cè)表明隨著細(xì)胞代數(shù)的增加，細(xì)胞周期向G2/M～S期進(jìn)展。PICs與MSCs相類(lèi)似，表達(dá)粘附相關(guān)分子，同樣不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物。細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)PICs具有向骨母細(xì)胞、軟骨母細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞分化的能力。PICs在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖活性均高于MSCs（P<0.05）。細(xì)胞周

19、期分析表明≈90％的MSCs處于細(xì)胞周期的G0/G1期；然而僅有≈64％的PICs處于細(xì)胞周期的G0/G1期。MSCs能夠不斷產(chǎn)生CFU-f，但是PICs的CFU-f形成效率低于MSCs（P<0.05）。RT-PCR證實(shí)MSCs和PICs均表達(dá)自我更新相關(guān)基因Oct3/4和Bmi-1，但是其在PICs的表達(dá)量低于MSCs。6.Klf4逆轉(zhuǎn)心包肌纖維母細(xì)胞至PICs的研究：與PICs相比，肌纖維母細(xì)胞多呈聚集樣生長(zhǎng)，細(xì)胞扁平、寬大，表達(dá)α

20、-SMA，第一代衰老、凋亡細(xì)胞就明顯高于PICs。肌纖維母細(xì)胞感染Klf4腺病毒（AdenoviralKlf4,AdKlf4）后細(xì)胞逐漸失去聚集樣生長(zhǎng)特征、并在傳代過(guò)程中由扁平細(xì)胞向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)變。AdKlf4感染早期（5天），細(xì)胞周期分析表明細(xì)胞周期阻滯。RT-PCR證實(shí)Klf4促進(jìn)p53基因的轉(zhuǎn)錄、并抑制I型膠原和III型膠原的mRNA表達(dá)，而Klf4對(duì)α-SMA的表達(dá)則無(wú)明顯作用。腺病毒感染5周時(shí)，行westernblot和RT-P

21、CR檢測(cè)均證實(shí)Klf4下調(diào)α-SMA和p53的表達(dá)。
　　 結(jié)論：1.纖維化和鈣化是IAPCP心包最主要的病理學(xué)特征；纖維化表現(xiàn)為PICs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外膠原沉積、彈力降解、MMPs和TIMPs的平衡失調(diào)；心包鈣化與PICs凋亡、骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)，而且鈣化心包中有骨化區(qū)域，提示IAPCP的心包鈣化是多種機(jī)制參與的、由PICs介導(dǎo)的主動(dòng)調(diào)控過(guò)程。2.通過(guò)研究TGF-β1、FGF-2、PDGF和BMP-2在IAPCP心

22、包中的表達(dá)及對(duì)PICs的作用，證實(shí)IAPCP心包纖維鈣化是多因素參與的主動(dòng)調(diào)控過(guò)程，其中心環(huán)節(jié)為PICs向肌纖維母細(xì)胞和骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。3.在纖維鈣化的自體心包瓣中獲得PICs向肌纖維母細(xì)胞和骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的證據(jù)，1例無(wú)纖維化的心包中也檢測(cè)到PICs向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，提示PICs的異常轉(zhuǎn)分化是心包修復(fù)材料衰敗的始作俑者。4.通過(guò)對(duì)比PICs和MSCs的生物學(xué)特征，證實(shí)PICs具有MSCs相似的表型可塑性（即多向分化潛力），而這種可塑