硝化和氧化修飾對烯醇酶功能的影響以及去鐵胺的干預(yù)作用.pdf

1、蛋白質(zhì)酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基一旦發(fā)生翻譯后修飾，就會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要的影響，進而與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系。在病理條件下，蛋白質(zhì)容易受到各種活性氧和活性氮自由基的損傷，發(fā)生蛋白質(zhì)酪氨酸硝化。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化常常伴隨有蛋白質(zhì)氧化，使得對蛋白質(zhì)酪氨酸硝化功能的研究變得復(fù)雜。此外，在蛋白質(zhì)硝化和氧化的過程中，生物體內(nèi)廣泛存在的微量元素鐵起著非常重要的催化作用。到目前為止，蛋白質(zhì)硝化和氧化修飾

2、與鐵的關(guān)系，及其對蛋白質(zhì)功能的不同影響尚未完全明了。本文從體外化學(xué)體系和動物模型兩個方面入手，首先以烯醇酶為研究對象，在體外化學(xué)體系中研究了由鐵誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝化和氧化修飾對烯醇酶功能的影響；并在此基礎(chǔ)上考察了抗氧化劑去鐵胺(DFO)對蛋白質(zhì)硝化和氧化損傷的干預(yù)作用；最后，在動物模型上研究了糖尿病大鼠組織中烯醇酶硝化和氧化的情況，探討了生物體內(nèi)的硝化和氧化修飾對烯醇酶功能的影響。主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面：
　　
　　

3、(1) 鐵在烯醇酶硝化和氧化修飾中的作用
　　 選取酵母烯醇酶為研究對象，研究了不同形態(tài)鐵催化NO2--H2O2和ONOO-對烯醇酶硝化、氧化及酶活的影響。實驗結(jié)果顯示，在催化NO2--H2O2和ONOO-導(dǎo)致的烯醇酶硝化/氧化損傷中，實驗濃度(10μmol/L)下的檸檬酸鐵(Citrate-Fe)和鐵蛋白(ferritin)對兩種損傷體系沒有顯著影響，而乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe)能促進ONOO-導(dǎo)致的烯醇酶硝化，但對NO

4、2--H2O2體系導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化和氧化無顯著作用。氯高鐵血紅素(hemin)和血紅蛋白(hemoglobin)不僅能有效催化NO2--H2O2硝化和氧化蛋白質(zhì)，同時它們也能有效促進ONOO-導(dǎo)致的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化，但對ONOO-導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化有顯著的抑制作用。游離的二價鐵(Fe2+)和三價鐵(Fe3+)能有效促進NO2--H2O2導(dǎo)致的烯醇酶氧化，但同時顯著地抑制ONOO-導(dǎo)致的烯醇酶硝化。此外，與蛋白質(zhì)硝化相比，烯醇酶活性與蛋白質(zhì)

5、羰基化關(guān)系更密切，蛋白質(zhì)氧化程度越強，酶活力下降越明顯。在hemin-NO2--H2O2導(dǎo)致的烯醇酶硝化/氧化損傷中，蛋白質(zhì)氧化(非巰基氧化)對酶活的影響要顯著強于蛋白質(zhì)酪氨酸硝化，但酪氨酸修飾對酶活也有一定的影響。這些結(jié)果表明，不同硝化途徑導(dǎo)致的烯醇酶硝化/氧化修飾受鐵的影響不同，除儲存態(tài)鐵如ferritin 外，其他形態(tài)的鐵都可能通過促進氧化或硝化影響烯醇酶的功能。
　　
　　 (2) 去鐵胺對蛋白質(zhì)硝化和氧化修飾的

6、干預(yù)作用
　　 研究了鐵螯合劑DFO對hemin-NO2--H2O2體系中蛋白質(zhì)硝化和氧化的影響，并對其作用機理進行初步探討。在hemin-NO2--H2O2體系中，這種抗氧化劑在低濃度(0.01-0.1mmol/L)時對蛋白質(zhì)(牛血清白蛋白、谷氨酸脫氫酶、人血漿蛋白)的硝化和氧化有完全不同的作用，它能有效抑制蛋白質(zhì)硝化，而對蛋白質(zhì)的羰基化卻有促進作用。在高濃度時，DFO則會發(fā)揮其抗氧化作用，抑制蛋白質(zhì)的硝化和氧化。進一步研究證

7、實，這種促氧化作用與heme-DFO復(fù)合物的形成密切相關(guān)。以上結(jié)果首次闡明了低濃度的DFO對heme-NO2--H2O2體系導(dǎo)致的蛋白質(zhì)硝化和氧化有完全不同的干預(yù)作用，研究結(jié)果對于深入認識DFO在臨床和醫(yī)藥上的毒副作用有重要的生理意義。
　　
　　 (3) Hemin-DFO 復(fù)合物促氧化機理的初步研究
　　 從自由基產(chǎn)生的角度初步研究了hemin-DFO復(fù)合物的促氧化機制。實驗結(jié)果表明，在DFO促進hemin-

8、H2O2體系導(dǎo)致的氧化損傷中，DFO促氧化作用的發(fā)揮需要與hemin和H2O2共存，其促氧化機理可能是促進了O2?-的生成。DFO完善的促氧化機制，有待進一步研究。
　　
　　 (4) 糖尿病大鼠組織中α-烯醇酶的硝化和氧化修飾
　　 通過腹腔注射鏈脲霉素建立糖尿病大鼠模型，同時選取α-烯醇酶作為靶蛋白，利用免疫沉淀和Western blotting 技術(shù)檢測糖尿病組織中α-烯醇酶的硝化和氧化，并采用高效液相色

9、譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定糖尿病大鼠心肌中α-烯醇酶的硝化位點，初步探討生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化和氧化對α-烯醇酶功能的影響。實驗結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中蛋白質(zhì)硝化水平明顯提高，而其羰基化水平無顯著變化，同時，糖尿病肝臟和血清中蛋白質(zhì)硝化和羰基化水平均顯著性提高。通過免疫沉淀的方法，確證了糖尿病組織和血清中α-烯醇酶是一種易于發(fā)生酪氨酸硝化的蛋白質(zhì)。與正常大鼠相比，糖尿病心肌、肝臟和血清中α-烯醇酶的表達和硝化水平顯著上升，同時其氧化