過(guò)量碘對(duì)甲狀腺的影響及硒的干預(yù)作用研究.pdf

1、本研究在觀察過(guò)量碘所致甲狀腺損傷的基礎(chǔ)上，從氧化/抗氧化平衡、脫碘酶、甲狀腺過(guò)氧化物酶(thyroidperoxidase，TPO)、組織蛋白酶(cathepsin)以及甲狀腺細(xì)胞凋亡等的變化入手，應(yīng)用熒光定量PCR、Westernblot和流式細(xì)胞術(shù)等方法觀察了過(guò)量碘對(duì)甲狀腺激素代謝過(guò)程中關(guān)鍵點(diǎn)的影響，同時(shí)通過(guò)補(bǔ)充不同劑量硒來(lái)觀察硒對(duì)過(guò)量碘導(dǎo)致的甲狀腺損傷的干預(yù)作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下： 第一部分過(guò)量碘對(duì)小鼠甲狀腺的影響及硒的干

2、預(yù)作用研究 目的:建立過(guò)量碘和硒干預(yù)的小鼠動(dòng)物模型，系統(tǒng)完整地觀察過(guò)量碘和不同劑量硒對(duì)甲狀腺的影響。全面深入地探討過(guò)量碘導(dǎo)致甲狀腺激素代謝紊亂以及硒干預(yù)的機(jī)制，并為選擇合適的硒干預(yù)劑量提供理論依據(jù)。 方法:將剛斷乳的清潔級(jí)Balb/c小鼠320只(雌性)按體重隨機(jī)分為8組，每組40只動(dòng)物，分別給予自來(lái)水或含碘酸鉀(potassiumiodate，KIO3)和/或亞硒酸鈉(sodiumselenite，Na2SeO3)的自

3、來(lái)水，正常組飲水內(nèi)不加碘或硒，過(guò)量碘組碘劑量為3000μg/L碘，過(guò)量碘補(bǔ)硒組分為6組，飲水中除含3000μg/L碘，還分別含不同濃度的Na2SeO3(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.75mg/L硒)。四個(gè)月后，觀察甲狀腺病理變化，測(cè)定小鼠尿和甲狀腺碘含量，尿和肝臟硒水平，血清甲狀腺激素水平，血漿、肝、腎和甲狀腺的氧化/抗氧化水平，肝、腎和甲狀腺1型脫碘酶(type1deiodinase，D1)的活性和mRNA水平，甲狀腺T

4、PO活性和mRNA水平。 結(jié)論:通過(guò)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)：①過(guò)量碘對(duì)甲狀腺激素代謝過(guò)程的影響主要表現(xiàn)為：氧化/抗氧化水平失衡，脫碘酶和TPO的活性和mRNA水平下降。②過(guò)量碘通過(guò)降低機(jī)體GSH-Px，TPO和D1的活性，導(dǎo)致甲狀腺激素合成和分解受到影響，導(dǎo)致激素水平失衡和甲狀腺腫大。③補(bǔ)充硒對(duì)過(guò)量碘導(dǎo)致的硒營(yíng)養(yǎng)水平低下，氧化/抗氧化水平失衡，脫碘酶、TPO活性和mRNA水平下降都有有效的干預(yù)作用。合適的硒干預(yù)劑量范圍是0.2～0.3mg

5、/L(0.05mg/kg·bw～0.075mg/kg·bw)。 第二部分過(guò)量碘對(duì)FRTL細(xì)胞的影響及硒的干預(yù)作用研究 目的:觀察過(guò)量碘對(duì)FRTL細(xì)胞的組織蛋白酶活性和mRNA水平、氧化/抗氧化平衡、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的mRNA和蛋白質(zhì)水平變化，并觀察不同劑量硒對(duì)過(guò)量碘引起這些指標(biāo)變化的干預(yù)作用。從而進(jìn)一步深入探討過(guò)量碘性膠質(zhì)潴留的發(fā)生機(jī)制。 方法:FRTL細(xì)胞培養(yǎng)于Kaighn's改良

6、的Ham'sF-12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)添加6種激素：1mU/ml牛促甲狀腺激素，0.01mg/ml胰島素，10nmol/L氫化可的松，0.005mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，10ng/ml生長(zhǎng)抑素和10ng/ml甘氨酰-組氨酰賴氨酸。測(cè)定下列指標(biāo)：①瓊脂糖凝膠電泳法觀察碘化鉀(potassiumiodide，KI)對(duì)FRTL細(xì)胞DNA的損傷以及硒的干預(yù)作用。細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組：培養(yǎng)基內(nèi)不加碘或硒；過(guò)量碘組：培養(yǎng)基內(nèi)加入KI，濃度為10mmol

7、/L；單硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入Na2SeO3，濃度為0.1μmol/LNa2SeO3；過(guò)量碘補(bǔ)硒組：培養(yǎng)基內(nèi)含10mmol/LKI和0.1μmol/LNa2SeO3。收集細(xì)胞，提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA電泳條帶。②流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)含量。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組：培養(yǎng)基內(nèi)不加碘或硒；過(guò)量碘組：培養(yǎng)基內(nèi)加入KI，濃度為1，5，10，50和100mmol/L；單硒組：培養(yǎng)基內(nèi)

8、加入亞硒酸鈉，硒濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0和5.0μmol/L；過(guò)量碘加硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入10mmol/LKI和不同濃度硒，硒濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0和5.0μmol/L。收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀FL-1530nm測(cè)定。③流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組：培養(yǎng)基內(nèi)不加碘或硒；過(guò)量碘組：培養(yǎng)基內(nèi)加入KI，濃度為1，5，10，50和100mmol/L；過(guò)量碘加硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入10mmol/LKI和不

9、同濃度Na2SeO3，硒濃度分別為0.1，0.5，1.0和5.0μmol/L。收集細(xì)胞，AnnexinV-FITC/7-AAD染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡率。④測(cè)定CB、CD、bcl-2和baxmRNA的水平。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組：培養(yǎng)基內(nèi)不加碘或硒；過(guò)量碘組：培養(yǎng)基內(nèi)含10mmol/LKI(bcl-2和bax)或50mmol/LKI(CB和CD)；單硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入Na2SeO3；濃度為0.1μmol/LNa2SeO3；過(guò)量碘補(bǔ)硒組：培養(yǎng)基加

10、入10mmol/LKI(bcl-2和bax)或50mmol/LKI(CB和CD)和0.1μmol/LNa2SeO3。收集細(xì)胞，熒光定量PCR測(cè)定CB、CD、bcl-2和baxmRNA的水平。⑤測(cè)定凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax蛋白水平。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組：培養(yǎng)基內(nèi)不加碘或硒；過(guò)量碘組：培養(yǎng)基內(nèi)含10mmol/LKI；單硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入0.1μmol/LNa2SeO3；過(guò)量碘補(bǔ)硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入10mmol/LKI和0.1μmol/L

11、Na2SeO3。收集細(xì)胞，Westernblot測(cè)定bcl-2和bax蛋白水平。⑥CB、CD活性的測(cè)定。細(xì)胞分組：正常對(duì)照組：培養(yǎng)基內(nèi)不加碘或硒；過(guò)量碘組：培養(yǎng)基內(nèi)加入不同劑量KI，濃度分別為1、5、10、50和100mmol/L；單硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入不同劑量Na2SeO3，硒濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μmol/L；過(guò)量碘加硒組：培養(yǎng)基內(nèi)加入10mmol/LKI和不同濃度Na2SeO3，硒濃度分別

12、為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μmol/L。收集細(xì)胞，測(cè)定CB、CD活性。 結(jié)論:通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①過(guò)量碘降低CB、CD活性和mRNA水平，影響膠質(zhì)的分解，這是導(dǎo)致過(guò)量碘性甲狀腺膠質(zhì)潴留的機(jī)制之一。補(bǔ)充0.1～0.5μmol/L劑量范圍的Na2SeO3可使CB、CD的損傷好轉(zhuǎn)，這也是硒可緩解膠質(zhì)潴留的原因之一。②過(guò)量碘通過(guò)影響細(xì)胞氧化/抗氧化水平以及凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增