IL-35通過調(diào)控CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)腎移植大鼠產(chǎn)生免疫耐受.pdf

1、本研究的目的是探討IL-35對(duì)腎移植大鼠模型免疫耐受的影響及其分子機(jī)制。首先，我們檢測(cè)IL-35干預(yù)后CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、CD4+CD25+ Treg、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ FOXP3+ Tregs百分比的變化，評(píng)價(jià)血清肌酐和細(xì)胞因子、以及形態(tài)病理學(xué)等指標(biāo)，從而分析IL-35對(duì)正常SD大鼠的作用，為下一步研究IL-35對(duì)腎移植大鼠模型免疫耐受的影響及其分子機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)和客觀依據(jù)。其次，本研究通過重組

2、鼠IL-35處理腎移植大鼠模型，在移植5、14天時(shí)取全血、腎移植物和脾臟檢測(cè)血清肌酐和細(xì)胞因子的表達(dá)水平;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、CD4+CD25+ Tregs、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ FOXP3+ Tregs的百分比變化，以及通過HE染色等手段觀察移植物形態(tài)病理學(xué)變化;詳細(xì)記錄大鼠腎移植模型的生存期并分析IL-35對(duì)大鼠腎移植的作用;廣泛而深入的探討IL-35誘導(dǎo)大鼠同種異體腎移植模型免疫耐受的

3、分子機(jī)制，為將來能在臨床器官抑制中提供一定的研究基礎(chǔ)和客觀依據(jù)。
　　本研究通過熒光定量PCR檢測(cè)大鼠外周血中IL-10、TGF-β、FOXP3等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平;通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠外周血中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β的蛋白表達(dá)水平;通過免疫印跡檢測(cè)大鼠腎組織和脾臟組織中FOXP3的蛋白表達(dá)水平。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、CD4+CD25+ T

4、regs、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ FOXP3+ Tregs的百分比。
　　熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-35處理可導(dǎo)致正常大鼠外周血中IL-10、TGF-β、FOXP3等因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示IL-35處理可導(dǎo)致正常大鼠外周血中CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ Tregs和CD4+CD25+ FOXP3+ Treg

5、s百分比增加。
　　為了研究IL-35對(duì)大鼠同種異體腎移植動(dòng)物模型免疫耐受的影響，我們采用Wistar→SD大鼠構(gòu)建了同種異體腎移植動(dòng)物模型，SD→SD大鼠構(gòu)建同種異體腎移植動(dòng)物假模型，并給與了IL-35干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為5組: IL-35+模型組、PBS+模型組、IL-35+假模型組、PBS+假模型組和PBS+正常大鼠組。分別在移植后第5和第14天取各組大鼠血清，通過ELISA檢測(cè)各組血清肌酐(Cr)和細(xì)胞因子（IL-2、IL-10

6、、IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ、和TGF-β）水平。采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Graph Pad繪圖。
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，第五天時(shí)IL-35干預(yù)導(dǎo)致模型組Cr(F=276.869,P＜0.001)、IL-6(F=3411.957，P＜0.001)、IL-17(F=173.206，P＜0.001)、IL-23(F=109.609，P＜0.001)、IFN-γ

7、(F=800.145，P＜0.001)、和TGF-β(F=122.876,P＜0.001)水平下降(N=3)，IL-2(F=39.471，P＜0.001)和IL-10(F=151.537,P＜0.001)水平升高(N=3)（圖1）。第14天時(shí)，IL-35于預(yù)導(dǎo)致模型組Cr(F=532.881，P＜0.001)、IL-6(F=158.974，P＜0.001)、IL-17(F=35.642，P＜0.001)、IL-23(F=87.057，P

8、＜0.001)、IFN-γ(F=190.986，P＜0.001)、和TGF-β(F=45.276,P＜0.001)水平下降(N=3)，IL-2(F=133.488，P＜0.001)和IL-10(F=274.343,P＜0.001)水平升高(圖2-2)(N=3)。
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示第5天時(shí)，不管是在正常組還是在腎移植模型組，IL-35干預(yù)后，F(xiàn)OXP3、 IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào);F值分別為F=2

9、1.289、 F=17.737、 F=188.327,P值分別為P＜0.001、 P＜0.001、 P＜0.001(N=3)。第14天時(shí)得到的檢測(cè)結(jié)果與第5天的結(jié)果相似，IL-35干預(yù)后，F(xiàn)OXP3、IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，F(xiàn)值分別為F=23.502、F=70.242、F=11.184,P值分別為P＜0.001、 P＜0.001、 P＜0.001(N=3)。
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示，不管是在正常組還

10、是在腎移植模型組，IL-35干預(yù)后，腎組織中FOXP3、 IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào);F值分別為F=115.560、 F=82.594、 F=36.138,P值分別為P＜0.001、 P＜0.001、 P＜0.001(N=3)。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，第5天時(shí)IL-35+模型組、PBS+模型組、IL-35+假模型組、PBS+假模型組和PBS+正常大鼠組，它們外周血中CD4+ Treg百分比分別為:40

11、.5％、28.19％、43.69％、47.06％和41.73％; CD8+ Tregs百分比分別為:26.18％、18.08％、27.92％、25.59％和21.77％; CD4+CD25+ Tregs百分比分別為:5.69％、4.51％、5.06％、5.34％和5.19％。第14天時(shí)IL35+模型組、PBS+模型組、IL-35+假模型組、PBS+假模型組和PBS+正常大鼠組，它們外周血中CD4+ Tregs百分比分別為:48.04％、

12、28.81％、51.74％、50.9％和50.49％; CD8+Tregs百分比分別為:25.5％、25.08％、23.14％、22.58％和23.61％; CD4+CD25+Tregs百分比分別為:5.44％、4.48％、4.93％、5.04％和4.83％。這說明IL-35干預(yù)顯著提高大鼠外周血中CD4+、CD8+和CD4+CD25+Tregs百分比。
　　綜上所述，IL-35通過調(diào)控CD4+CD25+FOXP3+Tregs參與