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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究的目的是探討IL-35對(duì)腎移植大鼠模型免疫耐受的影響及其分子機(jī)制。首先,我們檢測(cè)IL-35干預(yù)后CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、CD4+CD25+ Treg、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ FOXP3+ Tregs百分比的變化,評(píng)價(jià)血清肌酐和細(xì)胞因子、以及形態(tài)病理學(xué)等指標(biāo),從而分析IL-35對(duì)正常SD大鼠的作用,為下一步研究IL-35對(duì)腎移植大鼠模型免疫耐受的影響及其分子機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)和客觀依據(jù)。其次,本研究通過重組
2、鼠IL-35處理腎移植大鼠模型,在移植5、14天時(shí)取全血、腎移植物和脾臟檢測(cè)血清肌酐和細(xì)胞因子的表達(dá)水平;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、CD4+CD25+ Tregs、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ FOXP3+ Tregs的百分比變化,以及通過HE染色等手段觀察移植物形態(tài)病理學(xué)變化;詳細(xì)記錄大鼠腎移植模型的生存期并分析IL-35對(duì)大鼠腎移植的作用;廣泛而深入的探討IL-35誘導(dǎo)大鼠同種異體腎移植模型免疫耐受的
3、分子機(jī)制,為將來能在臨床器官抑制中提供一定的研究基礎(chǔ)和客觀依據(jù)。
本研究通過熒光定量PCR檢測(cè)大鼠外周血中IL-10、TGF-β、FOXP3等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平;通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠外周血中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、TGF-β的蛋白表達(dá)水平;通過免疫印跡檢測(cè)大鼠腎組織和脾臟組織中FOXP3的蛋白表達(dá)水平。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、CD4+CD25+ T
4、regs、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ FOXP3+ Tregs的百分比。
熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,IL-35處理可導(dǎo)致正常大鼠外周血中IL-10、TGF-β、FOXP3等因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示IL-35處理可導(dǎo)致正常大鼠外周血中CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞、FOXP3+細(xì)胞、CD4+CD25+ Tregs和CD4+CD25+ FOXP3+ Treg
5、s百分比增加。
為了研究IL-35對(duì)大鼠同種異體腎移植動(dòng)物模型免疫耐受的影響,我們采用Wistar→SD大鼠構(gòu)建了同種異體腎移植動(dòng)物模型,SD→SD大鼠構(gòu)建同種異體腎移植動(dòng)物假模型,并給與了IL-35干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為5組: IL-35+模型組、PBS+模型組、IL-35+假模型組、PBS+假模型組和PBS+正常大鼠組。分別在移植后第5和第14天取各組大鼠血清,通過ELISA檢測(cè)各組血清肌酐(Cr)和細(xì)胞因子(IL-2、IL-10
6、、IL-17、IL-23、IL-6、IFN-γ、和TGF-β)水平。采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用Graph Pad繪圖。
ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,第五天時(shí)IL-35干預(yù)導(dǎo)致模型組Cr(F=276.869,P<0.001)、IL-6(F=3411.957,P<0.001)、IL-17(F=173.206,P<0.001)、IL-23(F=109.609,P<0.001)、IFN-γ
7、(F=800.145,P<0.001)、和TGF-β(F=122.876,P<0.001)水平下降(N=3),IL-2(F=39.471,P<0.001)和IL-10(F=151.537,P<0.001)水平升高(N=3)(圖1)。第14天時(shí),IL-35于預(yù)導(dǎo)致模型組Cr(F=532.881,P<0.001)、IL-6(F=158.974,P<0.001)、IL-17(F=35.642,P<0.001)、IL-23(F=87.057,P
8、<0.001)、IFN-γ(F=190.986,P<0.001)、和TGF-β(F=45.276,P<0.001)水平下降(N=3),IL-2(F=133.488,P<0.001)和IL-10(F=274.343,P<0.001)水平升高(圖2-2)(N=3)。
熒光定量PCR結(jié)果顯示第5天時(shí),不管是在正常組還是在腎移植模型組,IL-35干預(yù)后,F(xiàn)OXP3、 IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào);F值分別為F=2
9、1.289、 F=17.737、 F=188.327,P值分別為P<0.001、 P<0.001、 P<0.001(N=3)。第14天時(shí)得到的檢測(cè)結(jié)果與第5天的結(jié)果相似,IL-35干預(yù)后,F(xiàn)OXP3、IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào),F(xiàn)值分別為F=23.502、F=70.242、F=11.184,P值分別為P<0.001、 P<0.001、 P<0.001(N=3)。
熒光定量PCR結(jié)果顯示,不管是在正常組還
10、是在腎移植模型組,IL-35干預(yù)后,腎組織中FOXP3、 IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào);F值分別為F=115.560、 F=82.594、 F=36.138,P值分別為P<0.001、 P<0.001、 P<0.001(N=3)。
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,第5天時(shí)IL-35+模型組、PBS+模型組、IL-35+假模型組、PBS+假模型組和PBS+正常大鼠組,它們外周血中CD4+ Treg百分比分別為:40
11、.5%、28.19%、43.69%、47.06%和41.73%; CD8+ Tregs百分比分別為:26.18%、18.08%、27.92%、25.59%和21.77%; CD4+CD25+ Tregs百分比分別為:5.69%、4.51%、5.06%、5.34%和5.19%。第14天時(shí)IL35+模型組、PBS+模型組、IL-35+假模型組、PBS+假模型組和PBS+正常大鼠組,它們外周血中CD4+ Tregs百分比分別為:48.04%、
12、28.81%、51.74%、50.9%和50.49%; CD8+Tregs百分比分別為:25.5%、25.08%、23.14%、22.58%和23.61%; CD4+CD25+Tregs百分比分別為:5.44%、4.48%、4.93%、5.04%和4.83%。這說明IL-35干預(yù)顯著提高大鼠外周血中CD4+、CD8+和CD4+CD25+Tregs百分比。
綜上所述,IL-35通過調(diào)控CD4+CD25+FOXP3+Tregs參與
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