間充質干細胞移植對實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的影響.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)是常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病(autoimmunedisease，AID)，患者表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘及相應的神經(jīng)系統(tǒng)運動障礙。實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimentalautoimmuneencephalomyelintis，EAE)是自身免疫性MS的模型，也被稱為實驗性變應性腦脊髓膜炎(experimentalallergicenceph

2、alomyelintis，EAE)，其臨床表現(xiàn)、病理特征和免疫異常等均與人類MS極其類似，故EAE常被用于研究MS病理進展機制和觀察判斷MS治療方案的有效性。大量MS免疫病理研究證實髓磷脂蛋白抗原被CD4+T細胞識別，誘導自身免疫應答。免疫細胞被異?；罨⑦w移進入CNS，在CNS與表達自身髓磷脂蛋白抗原的細胞相互作用，通過一系列炎癥因子最終導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病變與效應性T細胞過度活化、炎癥細胞在CNS浸潤、

3、前炎癥細胞因子和介質的產(chǎn)生高度相關。Th1和Th17產(chǎn)生的細胞因子如干擾素-γ(interferon，IFN-γ）、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF-α)、白細胞介素-2(interleukin2，IL-2)和IL-17能加速疾病進展，甚至IFN-γ能誘導脫髓鞘和神經(jīng)元損傷。Th2細胞和CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Treg)能抑制自身免疫反應，通過產(chǎn)生細胞因子IL-10、

4、轉化生長因子-β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）、IL-4限制疾病進展。有研究表明EAE小鼠Treg細胞數(shù)量和免疫抑制功能均降低，給EAE小鼠輸入功能性Treg細胞能改善其病理狀況。
　　間充質干細胞(Mesenchymalstemcell，MSC)是骨髓中除造血干細胞外的成體干細胞，廣泛存在于骨髓和肝臟等多種組織。MSCs具有多潛能、自我更新和潛在的多向分化能力。MSCs能分化成各種中胚層

5、起源的組織，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。MSCs很容易獲得，具有強大的潛在體外擴增能力，且免疫原性弱，因此MSC作為組織再生的種子細胞具有良好的臨床應用前景。MSCs也被發(fā)現(xiàn)具有顯著的免疫調節(jié)活性，能抑制T細胞、B細胞和NK細胞增殖，能誘導產(chǎn)生Tregs，也能抑制抗原提呈細胞(antigenpresentingcell，APC)成熟及其功能。上述各種研究報道表明，MSCs在治療自身免疫病方面有潛在的應用前景，但有關機制仍不十分清楚

6、，本研究旨在通過探討MSCs移植對EAE小鼠體內免疫器官中Treg數(shù)量、Foxp3、IL-10、TGF-β的影響，揭示MSCs對人類自身免疫病MS治療的機制。
　　材料與方法：
　　1、實驗動物:選擇6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠用于EAE模型制作;選擇雄性C57BL/6J小鼠做為同基因MSCs移植細胞來源，選擇雄性Balb/c小鼠做為異基因MSCs移植細胞來源。
　　2、免疫原的制備:選擇髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(

7、myelinoligodendrogliaglycoprotein，MOG)的MOG35-55多肽（氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）做抗原，等體積與完全弗氏佐劑(completeFreundadjuvant，CFA)充分混勻制成油包水樣乳劑，即為免疫原。
　　3、EAE模型的制作和神經(jīng)功能評分:通過給C57BL/6J小鼠多點多次注射免疫原，誘導小鼠成為EAE模型。每日觀察小鼠運動、飲食等，記錄小鼠癥狀、體征

8、、體重變化，參照Kono等的評分標準進行神經(jīng)功能評分。免疫原致敏14-20d，凡評分≥1分者可作為EAE模型。
　　4、小鼠MSCs的分離和培養(yǎng):用PBS沖洗C57BL/6J和BALB/c小鼠脛、腓骨，獲得骨髓細胞，溶解紅細胞后，將106/ml骨髓細胞置MSC培養(yǎng)液5％CO237℃孵育。72h去除非粘附細胞，待貼壁細胞融合至80％～90％培養(yǎng)瓶壁時，用胰蛋白酶消化，洗滌后加入MSC培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)至10～15d。給每只實驗鼠尾靜

9、脈注射細胞總數(shù)為106MSCs。
　　MSC擴增培養(yǎng)液:高糖DMEM(DulbeccomodifiedEaglesmedium，Gibco產(chǎn)品)，熱滅活10％胎牛血清，50μg/mLgentamycin，2mML-glutamine，100μMnon-essentialaminoacids,10mMHEPES,55μM2-Mecaptoethanol。
　　5、MSCs移植:將40只C57BL/6J小鼠分為4組，每組10只。

10、A、B、C組為EAE誘導組，符合EAE神經(jīng)功能評分條件。在EAE誘導后第20～22d，A組小鼠經(jīng)尾靜脈注射106（200μL）BALB/c小鼠MSCs（異基因MSCs移植組），B組EAE小鼠經(jīng)尾靜脈注射106（200μL）C57BL/6J小鼠MSCs（同基因MSCs移植組），C組EAE小鼠經(jīng)尾靜脈注射200μLPBS（為EAE對照組），D組小鼠為非EAE誘導的正常小鼠（正常對照組）。
　　6、流式細胞術分析:在MSCs移植40d，

11、處死小鼠，分別無菌獲取胸腺、脾臟、淋巴結，通過機械研磨、裂解紅細胞后制成單個核細胞懸液，利用反復離心法將細胞用含1％BSA和0.1％sodiumazide的PBS洗3次，加入FITC-抗小鼠CD4mAb（0.125μg/106細胞）、APC-抗小鼠CD25mAb（0.06μg/106細胞，eBioscience產(chǎn)品)，檢測細胞膜表面CD4、CD25分子的表達，以同型抗體做對照，冰上避光孵育30min。對于細胞內存在的Foxp3檢測，需要

12、首先將細胞固定、破膜處理（用Foxp3stainingbuffer，eBioscience產(chǎn)品），再用PE-抗小鼠Foxp3mAbs(0.5μg/106細胞，eBioscience)染色。染色后細胞用流式細胞儀FACSCalibur(BD)檢測。
　　7、Realtime(RT)-PCR法檢測Foxp3、TGF-TGF-β1、IL-10mRNA表達:分別從MSCs移植后20d、40d、60d各組小鼠中摘取胸腺、脾臟和淋巴結，制成單

13、細胞懸液，分別于107個胸腺細胞、脾臟細胞和淋巴結細胞中加入Trizol試劑（Invitrogen產(chǎn)品）提取總RNA，用RTKit（Takara產(chǎn)品）反轉錄成cDNA，用SYBRgreenIrealtimePCRKit(Takara)試劑盒進行Foxp3、TGF-TGF-β1和IL-10mRNA檢測。
　　8、CD4+CD25+調節(jié)性T細胞對CD4+CD25-效應T細胞增殖的抑制作用:采用CD4+CD25+細胞分選試劑和免疫磁珠法

14、分選出正常小鼠CD4+CD25-T細胞，經(jīng)CD3單抗和CD28單抗活化在含IL-2的培養(yǎng)基中，與CD4+CD25+T細胞共培養(yǎng)，MTT法檢測細胞增殖。即:將正常對照組小鼠的CD4+CD25-細胞100μL加入到各包被孔中，每孔分別正常對照組、EAE組、異基因MSCs移植組、同基因MSCs移植組的CD4+CD25+T細胞100μL，設3個復孔，置5％CO2飽和濕度37℃培養(yǎng)24h。每孔加入MTT(5mg/mL)20)μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小

15、心吸去培養(yǎng)孔中上清，每孔加入二甲亞砜100μL，反復吹打使細胞裂解，用酶標分析儀570nm記錄各孔吸光度值（A值）。
　　9、統(tǒng)計學分析:實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，利用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計結果p＜0.05為有限制性差異。
　　結果：
　　1、MSCs體外培養(yǎng)、增殖特征:初分離的骨髓單個核細胞在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)為小球形，誘導培養(yǎng)3～4d后部分細胞貼附于培養(yǎng)瓶壁，形狀似紡錘形，有較強折光性。培養(yǎng)至7～10

16、d，絕大多數(shù)細胞貼附于瓶壁，并逐漸生長形成分散的或條索狀聚集狀態(tài)，細胞體積顯著增大。細胞被繼續(xù)傳代培養(yǎng)，將反復傳3～4代的MSCs用于細胞移植。
　　2、MSCs移植改善EAE小鼠臨床評分
　　每日觀察和記錄各組小鼠EAE一般情況和神經(jīng)功能評分，結果顯示:EAE誘導14d，EAE組小鼠出現(xiàn)顯著異常表現(xiàn)，85％EAE誘導小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能評分增加，達到2分以上，部分小鼠出現(xiàn)尾部癱瘓、弓背，部分小鼠表現(xiàn)為后肢無力、甚至癱瘓，也有部

17、分小鼠在5d內直接發(fā)展到前肢無力。異基因MSCs移植組和同基因MSCs移植組，神經(jīng)功能評分顯著降低，并隨時間延長，神經(jīng)功能評分降低更加明顯，在一周內神經(jīng)功能評分迅速達到最低值，MSCs移植后神經(jīng)功能持續(xù)改善，維持20d以上。經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示:異基因MSCs移植組與EAE對照組相比有顯著差異，p＜0.01;同基因MSCs移植組與EAE對照組相比有顯著差異，p＜0.01;異基因MSCs移植組與同基因MSCs移植組相比，無顯著差異，p＞0.0

18、5。
　　3、MSCs移植影響EAE小鼠脾臟、淋巴結、胸腺CD4+CD25+Foxp3+T細胞的數(shù)量
　　在MSCs移植20d，無菌獲取胸腺、脾臟、腸系膜和腋窩淋巴結，制備單細胞懸液，用熒光標記抗體和流式細胞術分析胸腺、脾臟和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例。結果顯示:脾臟中的CD4+CD25+Foxp3+T細胞，EAE組顯著低于正常對照組(p=0.032)、異基因MSCs移植組(p＜0.01)和同基因MS

19、Cs移植組(p=0.018)。淋巴結中的CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例，EAE組也顯著低于正常對照組、異基因MSCs移植組及同基因MSCs移植組，p值均＜0.01。胸腺中的CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例，EAE組低于正常對照組(p=0.025、異基因MSCs移植組(p＜0.01)及同基因MSCs移植組(p=0.036)。
　　4、MSCs移植改變EAE小鼠胸腺、脾臟Foxp3，TGF-β1andIL-10mRN

20、A水平
　　分別在MSCs移植20d、40d、60d處死小鼠，摘取胸腺、脾臟、淋巴結，制備單個核細胞，從107個細胞中提取總RNA，通過RT-PCR法檢測Foxp3、TGF-β1和IL-10的表達。結果顯示:Foxp3、TGF-β1和IL-10mRNA在正常對照組胸腺、脾臟和淋巴結穩(wěn)定表達，EAE組小鼠Foxp3mRNA低表達，并逐漸下降至60d時間點達到最低。EAE組和正常對照組相比，上述各指標均有顯著差異，p＜0.01。

21、>　　在異基因MSCs移植20d，小鼠脾臟、淋巴結和胸腺Foxp3mRNA呈現(xiàn)低表達，隨后逐漸增高正常水平，在異基因MSCs移植60d，與EAE組相比各器官Foxp3mRNA表達均有顯著差異，p＜0.01。
　　在同基因MSCs移植組，脾臟、淋巴結、胸腺Foxp3mRNA的表達結果與異基因MSCs移植組相似，與EAE組相比各項指標均有顯著差異，p＜0.01。
　　脾臟、淋巴結、胸腺TGF-β1mRNA在EAE組、MSCs異基

22、因移植組和同基因移植組均表現(xiàn)為低表達（MSCs移植20d時），EAE組TGF-β1mRNA持續(xù)降低，并在60d時達到最低點，與正常對照組相比有顯著差異，p＜0.01。異基因移植組和同基因移植組隨時間延長TGF-β1mRNA水平逐漸增加至正常水平，與EAE組相比有顯著差異，p＜0.01。
　　IL-10mRNA在脾臟、淋巴結和胸腺中的表達水平有相似的趨勢，異基因移植組、同基因移植組與EAE組相比，均有顯著差異，p＜0.01。

23、　　5、CD4+CD25+T細胞(Treg)對CD4+CD25-T細胞(Teff)增殖的抑制作用
　　EAE組小鼠CD4+CD25+T細胞對CD4+CD25-效應T細胞增殖的抑制作用顯著降低，與正常對照組相比，P＜0.01;同基因MSCs移植組與異基因MSCs移植組CD4+CD25+T細胞對CD4+CD25-效應T細胞增殖作用顯著增強，與EAE組相比有顯著差異，P＜0.01;同基因MSCs移植組與異基因MSCs移植組相比，無顯著差

24、異，P＞0.05。
　　結論：
　　本研究利用MOG多肽注射小鼠成功誘導了實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)小鼠模型，并通過注射骨髓間充質干細胞(MSCs)使EAE小鼠神經(jīng)功能評分降低，使胸腺、脾臟和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+T細胞百分率增加和Foxp3、TGF-β1和IL-10mRNA表達水平增加。說明MSCs移植能預防EAE進展，并可成為臨床治療MS的手段，其中MSCs移植所致CD4+CD25+Foxp3+