豬偽狂犬病病毒Fa株糖蛋白gD基因的分子克隆、原核表達(dá)及核酸疫苗免疫效力研究.pdf

1、本研究以豬偽狂犬病毒(PRV)Fa株的毒種為材料，擴(kuò)增克隆gD基因，同時(shí)利用所獲得的目的基因進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)及真核表達(dá)載體構(gòu)建及免疫效力的研究，主要研究內(nèi)容如下： 1.gD基因的分子克隆與序列分析 參照GenBank中登錄號(hào)為AY217094的PRVFa株的gD基因序列，利用Oligo6.0和Premier軟件輔助設(shè)計(jì)1對(duì)引物，以Vero細(xì)胞增殖培養(yǎng)的PRV為材料，采用PCR技術(shù)擴(kuò)出gD基因，用TA克隆法連接到

2、pMD18-T-vector載體上，構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD-gD。并將陽性菌送公司測序，序列測定顯示，克隆出1245bp片段，包含1個(gè)1209bp的ORF框，編碼402個(gè)氨基酸。將測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外的不同來源的12個(gè)毒株進(jìn)行生物學(xué)信息比較分析，克隆的gD基因核苷酸序列同源性在98.2％～99.6％，氨基酸同源性在96.3％～98.8％，不同的PRV毒株間的gD基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。 2.gD

3、基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及活性檢測 為了擴(kuò)增出去信號(hào)肽的gD基因(gD-n)，重新設(shè)計(jì)1對(duì)引物，以pMD-gD為材料，采用PCR技術(shù)擴(kuò)出目的基因，用TA克隆法連接到pMD18-T-vector載體上，構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD-gD-n，將酶切鑒定正確的陽性菌送公司測序，測序結(jié)果與模板中去掉信號(hào)肽的對(duì)應(yīng)序列完全一致。 用EcoRI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶切下目的基因(gD-n)，再定向連接到pET32a+中，獲得重組原核表達(dá)載體

4、pET-gD-n。酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化到高效表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)研究。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測顯示，約在63.8KDa，處出現(xiàn)一條特異表達(dá)帶，原核重組表達(dá)載體pET-gD-n表達(dá)出與預(yù)期推測的融合目的蛋白，westernBlot檢測顯示表達(dá)的去信號(hào)肽融合目的蛋白具有特異的反應(yīng)原性。 3.gD基因核酸疫苗構(gòu)建及其免疫效力的研究 以pMD-gD為材料，用EcoRI和XbaI限制性內(nèi)切酶

5、切下目的基因，再定向連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、pCI-neo中，再用相同的內(nèi)切酶酶切鑒定，成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcD-gD，pCI-gD。 本實(shí)驗(yàn)將PRVgD基因的2個(gè)核酸疫苗pcD-gD，pCI-gD和細(xì)胞因子IL-15的表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，肌注免疫Balb/c小鼠兩次，于首免后第2、4、6、8周采2份血樣，一份分離血清，做間接ELISA抗體檢測和中和抗體檢測；一份加抗凝劑，做外周血CD4+，CD8+T淋巴細(xì)

6、胞的測定。與空白和空載體比較，構(gòu)建的2個(gè)真核表達(dá)載體都誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PRV的特異性IgG抗體和中和抗體，第2次加強(qiáng)免疫后，抗體得到明顯的提高，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程產(chǎn)生的抗體沒有超過陽性對(duì)照滅活PRV組的水平。但是整個(gè)抗體水平相對(duì)穩(wěn)定，提示DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體維持時(shí)間較長。重組真核表達(dá)載體pcD-gD，pCI-gD刺激機(jī)體產(chǎn)生CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞方面較為顯著，與陽性對(duì)照沒有明顯的差異。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的基因疫苗能夠抵抗病