豬偽狂犬病病毒Fa株糖蛋白gD基因的分子克隆、原核表達及核酸疫苗免疫效力研究.pdf

1、本研究以豬偽狂犬病毒(PRV)Fa株的毒種為材料，擴增克隆gD基因，同時利用所獲得的目的基因進行原核表達載體構(gòu)建、表達及真核表達載體構(gòu)建及免疫效力的研究，主要研究內(nèi)容如下： 1.gD基因的分子克隆與序列分析 參照GenBank中登錄號為AY217094的PRVFa株的gD基因序列，利用Oligo6.0和Premier軟件輔助設(shè)計1對引物，以Vero細胞增殖培養(yǎng)的PRV為材料，采用PCR技術(shù)擴出gD基因，用TA克隆法連接到

2、pMD18-T-vector載體上，構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD-gD。并將陽性菌送公司測序，序列測定顯示，克隆出1245bp片段，包含1個1209bp的ORF框，編碼402個氨基酸。將測序結(jié)果及推導的氨基酸序列與國內(nèi)外的不同來源的12個毒株進行生物學信息比較分析，克隆的gD基因核苷酸序列同源性在98.2％～99.6％，氨基酸同源性在96.3％～98.8％，不同的PRV毒株間的gD基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。 2.gD

3、基因原核表達載體構(gòu)建及活性檢測 為了擴增出去信號肽的gD基因(gD-n)，重新設(shè)計1對引物，以pMD-gD為材料，采用PCR技術(shù)擴出目的基因，用TA克隆法連接到pMD18-T-vector載體上，構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD-gD-n，將酶切鑒定正確的陽性菌送公司測序，測序結(jié)果與模板中去掉信號肽的對應(yīng)序列完全一致。 用EcoRI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶切下目的基因(gD-n)，再定向連接到pET32a+中，獲得重組原核表達載體

4、pET-gD-n。酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化到高效表達菌株E.coliBL21(DE3)進行表達研究。經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE電泳檢測顯示，約在63.8KDa，處出現(xiàn)一條特異表達帶，原核重組表達載體pET-gD-n表達出與預期推測的融合目的蛋白，westernBlot檢測顯示表達的去信號肽融合目的蛋白具有特異的反應(yīng)原性。 3.gD基因核酸疫苗構(gòu)建及其免疫效力的研究 以pMD-gD為材料，用EcoRI和XbaI限制性內(nèi)切酶

5、切下目的基因，再定向連接到真核表達載體pcDNA3.1(+)、pCI-neo中，再用相同的內(nèi)切酶酶切鑒定，成功構(gòu)建重組真核表達載體pcD-gD，pCI-gD。 本實驗將PRVgD基因的2個核酸疫苗pcD-gD，pCI-gD和細胞因子IL-15的表達質(zhì)粒免疫小鼠，肌注免疫Balb/c小鼠兩次，于首免后第2、4、6、8周采2份血樣，一份分離血清，做間接ELISA抗體檢測和中和抗體檢測；一份加抗凝劑，做外周血CD4+，CD8+T淋巴細

6、胞的測定。與空白和空載體比較，構(gòu)建的2個真核表達載體都誘導小鼠產(chǎn)生PRV的特異性IgG抗體和中和抗體，第2次加強免疫后，抗體得到明顯的提高，整個實驗過程產(chǎn)生的抗體沒有超過陽性對照滅活PRV組的水平。但是整個抗體水平相對穩(wěn)定，提示DNA疫苗誘導的抗體維持時間較長。重組真核表達載體pcD-gD，pCI-gD刺激機體產(chǎn)生CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞方面較為顯著，與陽性對照沒有明顯的差異。攻毒保護實驗進一步證實構(gòu)建的基因疫苗能夠抵抗病