偽狂犬病病毒宿主關(guān)閉蛋白的基因克隆、表達(dá)及其結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、α皰疹病毒在感染細(xì)胞過程中,普遍產(chǎn)生對細(xì)胞內(nèi)大分子合成的顯著抑制作用,從而引起宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的快速關(guān)閉.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒1型中UL41基因編碼的磷酸化蛋白與宿主細(xì)胞核糖核蛋白體的關(guān)閉和mRNA降解有關(guān),該蛋白質(zhì)被命名為病毒宿主關(guān)閉蛋白(virion host shutoff protein,VHS),是構(gòu)成病毒顆粒的次要結(jié)構(gòu)組分——間質(zhì)蛋白.在病毒感染裂解期,VHS蛋白進(jìn)入細(xì)胞后立即觸發(fā)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的快速關(guān)閉和所有m

2、RNA(包括宿主細(xì)胞及病毒)的降解,使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯從宿主mRNA轉(zhuǎn)向病毒mRNA,并推動不同時期(立即早期α、早期β、晚期γ)病毒基因的有序表達(dá).病毒感染后期,病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP16(由UL48基因編碼)可以抑制VHS蛋白的活性,并將VHS蛋白包裝進(jìn)病毒顆粒.此外,許多研究表明VHS蛋白還是一個重要的毒力因子,通過干擾IFN-α/β介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)、降低宿主細(xì)胞MHC Ⅰ和Ⅱ類分子的表達(dá)、減少免疫系統(tǒng)中病毒抗原的提呈以及抑制宿主先

3、天免疫反應(yīng)等在α皰疹病毒的發(fā)病機(jī)理和免疫逃避過程中發(fā)揮重要作用.然而,目前關(guān)于偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)中VHS蛋白的研究卻很少,尚不清楚其是否具有與其它α皰疹病毒VHS相似的生物學(xué)活性.因此,克隆并研究PRV和VHS蛋白基因不僅可以鑒定PRV中VHS蛋白的生物學(xué)特性,而且對于闡明PRV的基因表達(dá)與調(diào)控、發(fā)病機(jī)理及潛伏感染機(jī)制等都具有重要意義,并為今后開發(fā)VHS基因缺失疫苗奠定基礎(chǔ).該研究通過PCR從偽

4、狂犬病病毒Ea株基因組聽放增到UL41全基因,序列測定發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段全長為1174bp,包含編碼VHS蛋白365個氨基酸的完整編碼區(qū).序列比較分析發(fā)現(xiàn)VHS蛋白具有4個保守區(qū),并且第三個保守區(qū)與核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域FEN-1(1A76)高度同源.用PROSPECT軟件預(yù)測的偽狂犬病病毒VHS蛋白三維結(jié)構(gòu)中含有10個α螺旋和22個β折疊,與單純皰疹病毒Ⅰ型的VHS蛋白三維結(jié)構(gòu)十分相似.說明PRV的VHS蛋白可能也是一個核酸酶,具有mRNA降解活

5、性.將UL41全基因克隆到表達(dá)載體pGEX-KG中GST下游,構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-UL41,并在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了GST-VHS融合蛋白的高效表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達(dá)的融合蛋白質(zhì)分子量為66KDa.將原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-UL41和pGEX-UL48分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌,大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白VHS和VP16.提取包涵體,復(fù)性和純化后免疫家兔,分別制備了抗VHS和VP16蛋白的高免血清.該研究還將UL41與