豬偽狂犬病毒變異株的分離鑒定及其gB、gE基因的原核表達.pdf

1、自2011年底以來，全國范圍內(nèi)多個豬場暴發(fā)了由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起的豬偽狂犬病（Pseudorabies; PR），大部分豬場在免疫過PRV gE基因缺失疫苗，且群體免疫抗體水平較高的情況下仍可發(fā)病，嚴重危害了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。本研究對河南省2012年以來不同地區(qū)發(fā)生PR豬場的14株P(guān)RV gE、TK基因分子變異規(guī)律進行分析；對2012年新鄉(xiāng)市某發(fā)病豬場采集的臨床病料進行了PRV分離鑒定；對分

2、離株的gB、gE基因進行原核表達和活性檢測。以期了解河南省PRV流行毒株的分子變異情況和為后續(xù)防控 PRV的疫苗研制及檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1、本研究從河南省多地規(guī)模化豬場采集疑似 PRV感染病料，并參考GeneBank上發(fā)表的 TK、gE基因序列設(shè)計擴增 TK、gE基因全長的引物，對不同來源地的14株 PRV分別進行 TK、gE基因進行 PCR擴增和克隆測序，通過DNAstar和MEGA6.0等軟件進行同源性分析和

3、遺傳進化分析。2、選取新鄉(xiāng)市某疑似 PR發(fā)病豬場病豬的腦、肺臟、淋巴結(jié)等組織樣品混合研磨，無菌處理后，經(jīng) PCR鑒定僅含有 PRV野毒株，取400μL上清接種于長勢良好且鋪滿單層的PK-15細胞上，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80％左右的細胞發(fā)生病變時，反復(fù)凍融三次離心取上清進行傳代接種，以此方法進行病毒的多代培養(yǎng)，每培養(yǎng)一代均留取少量用于 PRV的鑒定；分別采用 PCR方法、IFA試驗、接種 BHK-21細胞和VERO細胞實驗、攻

4、毒小鼠實驗等方法鑒定所分離PRV；采用噬斑純化方法對PRV進行純化；采用Reed-Muench法計算培養(yǎng)8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h后病毒的TCID50，并繪制病毒生長曲線；將滅活后的PRV免疫小鼠，共免疫4次，最后一次免疫后3天采集小鼠血并分離血清，采用IDEXX gB、gE試劑盒測定小鼠抗體效價。3、根據(jù)GeneBank上發(fā)表的gB、gE基因序列，結(jié)合文獻報道，設(shè)計兩條特異性引物分別擴增 gB、gE基因部

5、分保守片段，將其克隆至pGEM-T easy克隆載體上，并亞克隆至表達載體pQE-30上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中誘導(dǎo)表達，對表達的蛋白進行純化；將純化的重組gB、gE蛋白（rPRV-gB、rPRV-gE)轉(zhuǎn)印到NC膜上，同時作為抗原包被ELISA反應(yīng)板上，采用已知的PRV陽性血清和陰性血清檢測重組蛋白的活性和特異性。
　　結(jié)果：1、14株河南分離株的gE基因氨基酸同源性為95.7%-99.8%，與2012年之前國內(nèi)分離的毒株同

6、源性較低（96.6%-98.9%），與2012年之后中國流行的毒株的同源性較高（除XX1外，同源性為98.7%-100%）；14株的TK基因氨基酸同源性為97.8%-100%，與疫苗株Bartha-K61株同源性為98.7%-99.6%，與2012年之后流行株氨基酸同源性為98.1%-100%。進化樹分析顯示：河南PRV流行毒株gE基因和TK基因均可分3個群，與國內(nèi)2012年之后分離的大多數(shù)毒株同處于基因1群；14個分離株與國內(nèi)2012

7、年之后分離的zj-01株、TJ株親緣關(guān)系較近，與國內(nèi)經(jīng)典毒株 Ea株、Min-A株、LA株次之，與國外 Becker株、Kaplan株和P-Prv株親緣關(guān)系較遠。14株P(guān)RV的TK基因較為保守，而gE基因存在很多的點突變（在第24-25、473位氨基酸位點各插入一個天冬氨酸可作為變異株的標(biāo)志）。2、新鄉(xiāng)豬場的病料中PCR檢測結(jié)果僅PRV野毒陽性，而豬瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬藍耳病毒（P

8、RRSV）、圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等均為陰性；將病料接種細胞后細胞均可發(fā)生病變，并可連續(xù)穩(wěn)定傳代；每一代次PRV細胞培養(yǎng)物 PCR鑒定結(jié)果均僅 PRV為陽性；IFA實驗有明顯熒光；接種BHK-21細胞、Vero細胞也均出現(xiàn)明顯細胞病變；攻毒均出現(xiàn)典型病變；經(jīng)過六輪噬斑純化得到高純度的PRV；據(jù)病毒生長曲線顯示病毒接種細胞后24 h病毒含量達到峰值，TCID50為10-6.71/0.1

9、 mL；滅活病毒免疫小鼠后，經(jīng)檢測效價均能達到1:10萬以上，表明所分離的PRV新發(fā)毒株具有良好的免疫原性。3、通過PCR擴增可得 gB基因條帶大小為621bp，gE基因條帶大小為633bp，與預(yù)期擴增片段大小一致；成功構(gòu)建了表達載體 pQE30-gB、pQE30-gE；誘導(dǎo)表達后的蛋白經(jīng)純化獲得了高純度的 rPRV-gB、rPRV-gE蛋白；經(jīng) Werstern-blot和 ELISA實驗結(jié)果表明所獲得的重組蛋白rPRV-gB、rPR

10、V-gE具有較高活性和特異性。
　　結(jié)論：1、目前河南省PRV流行毒株為國內(nèi)新發(fā)流行變異毒株，其特征為與國內(nèi)2012年之前所分離的經(jīng)典毒株相比gE基因在第24-25、473位氨基酸位點各插入一個天冬氨酸可作為變異株的標(biāo)志，提示可能是當(dāng)前疫苗保護力下降的主要原因。2、成功分離鑒定了一株新發(fā) PRV變異株（HeNXX-2012），該毒株純度較高可穩(wěn)定傳代，TCID50可達10-6.71/0.1 mL，且具有較好的免疫原性，為后期PRV