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文檔簡介
1、本試驗從福州郊區(qū)某豬場病死豬的肺臟中分離到一株病毒,運用相關(guān)的試驗方法對該分離病毒進行鑒定,結(jié)果證實該分離病毒為偽狂犬病病毒,并對該株病毒的TK(胸苷激酶)基因進行克隆和序列分析。 該株病毒初次接種Marc-145細胞未見明顯的細胞病變,經(jīng)過一代盲傳,從第二代開始產(chǎn)生了細胞圓縮、聚集、溶解和脫落等典型的細胞病變,并可見到大量的多核巨細胞,產(chǎn)生細胞病變的時間為48h左右;經(jīng)過連續(xù)傳代后,產(chǎn)生細胞病變的時間明顯縮短,基本穩(wěn)定在20h
2、左右。在電鏡下能觀察到直徑約為150-180nm、有囊膜、呈圓形或橢圓形的病毒粒子,囊膜表面有呈放射狀排列的纖突;細胞核內(nèi)可見到包涵體;病毒粒子在胞質(zhì)囊泡和細胞膜上出芽生殖。該病毒對雞紅細胞和大鼠紅細胞沒有血凝活性,而對小白鼠紅細胞具有血凝活性,其血凝效價為1:64。對雞胚做絨毛尿囊膜接種時,死亡的雞胚在絨毛尿囊膜上出現(xiàn)白色痘斑樣病變,尿囊膜水腫、充血,胚體頭蓋部突起,全身彌漫性出血;而對雞胚做尿囊腔接種時,胚體出現(xiàn)類似的病變,但在絨毛
3、尿囊膜上沒有出現(xiàn)痘斑樣病變。病毒液接種家兔和小白鼠,分別經(jīng)過59h、96h死亡,兩者都出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,但沒有出現(xiàn)奇癢和啃咬的癥狀。病毒液接種斷奶仔豬,仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,同時體溫升高達41℃;接毒10天后體溫和食欲恢復(fù)正常,神經(jīng)癥狀消失,仔豬表現(xiàn)為耐過。用分離病毒感染細胞,提取病毒和細胞的總DNA,在PRV的TK基因上設(shè)計一對特異性引物,通過PCR技術(shù)成功擴增出約917bp的特異片段,與預(yù)期結(jié)果一致,進而從核酸水平證實了所分離的病毒為PRV
4、。以上試驗結(jié)果表明從該豬場分離到的病毒是豬偽狂犬病病毒,并命名為FZJX株。 通過對TK基因進行克隆和序列分析,我們發(fā)現(xiàn)PCR擴增的917bp基因片段中含有一個長為897bp的開放閱讀框,共編碼298個氨基酸。利用DNAStar軟件將該序列與GenBank中收錄的Ea株(序列號為AF080571)、SH株(序列號為AF199413)、Min-A株(序列號為171242)、LA株(序列號為AY173125s1)、Korea株(序列
5、號為217095)、USA株(序列號為E00505)、Spain株(序列號為X55001)、FJFZ株(序列號為FJ477295)的TK基因進行序列比對,并推導出其編碼的氨基酸序列,分別對其進行同源性比較和進化樹分析。同源性比較結(jié)果顯示,F(xiàn)ZJX株TK基因與USA株、Ea株、FJFZ株、Korea株、LA株、Min-A株、SH株、Spain株TK基因的同源性分別為:93.3%、99.7%、99.3%、99.4%、99.8%、98.3%、
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