建立OsPT6基因遺傳轉(zhuǎn)化體系培育磷高效吸收菜用大豆新種質(zhì).pdf

1、菜用大豆[Glycine max(L.) Merr.]，又稱(chēng)毛豆，其籽粒富含蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素、礦質(zhì)元素和膳食纖維等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，因而深受消費(fèi)者青睞。隨著市場(chǎng)需求的增大，其栽培面積正迅速擴(kuò)大。菜用大豆在我國(guó)栽培歷史悠久，其主要產(chǎn)區(qū)在長(zhǎng)江中下游和東南沿海地區(qū)。然而，由于我國(guó)南方紅壤地區(qū)土壤特殊的理化性質(zhì)，磷素極易被固定，使得自然土壤中的有效磷含量非常低，限制著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。低磷脅迫已經(jīng)成為限制菜用大豆生產(chǎn)的主要因素之一，嚴(yán)重影響

2、菜用大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。水稻OsPT6基因編碼高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在磷素的吸收和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用。為提高菜用大豆的磷素吸收，獲得磷高效吸收菜用大豆新種質(zhì)，本研究以菜用大豆品種‘NY-1001，為轉(zhuǎn)化受體，將OsPT6基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化菜用大豆，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，并采用營(yíng)養(yǎng)液栽培法對(duì)轉(zhuǎn)OsPT6基因菜用大豆T2代植株進(jìn)行耐低磷鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)NCBI公布的水稻OsPT6基因序列，設(shè)計(jì)特異

3、性引物，PCR擴(kuò)增OsPT6基因編碼區(qū)，基因兩端分別引入酶切位點(diǎn)SacⅠ和XbaⅠ，通過(guò)酶切連接的方法將OsPT6基因插入到經(jīng)改造的pCAMBIA3301載體中CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子之間，成功構(gòu)建了以gus基因作為報(bào)告基因，bar基因作為選擇標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-OsPT6。經(jīng)酶切驗(yàn)證后，將該載體通過(guò)凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，得到EHA105/pCAMBIA3301-OsPT6工程菌。

4、　　2.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法將OsPT6基因?qū)氩擞么蠖?，成功獲得2株可育的轉(zhuǎn)基因植株（編號(hào)12PT6-1和12PT6-2）。Southern雜交分析顯示，OsPT6以單拷貝的形式成功整合到菜用大豆的基因組中。Basta抗性檢測(cè)表明轉(zhuǎn)基因植株具有除草劑抗性。GUS組織化學(xué)分析和PCR檢測(cè)表明，外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代穩(wěn)定遺傳，并且在T1代中出現(xiàn)了分離，分離比符合盂德?tīng)?∶1遺傳分離模型。通過(guò)篩選獲得了三個(gè)T2代純合體轉(zhuǎn)基因株系

5、（12PT6-1-1、12PT6-1-14和12PT6-2-8），并且qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明OsPT6基因在純合體轉(zhuǎn)基因植株中超表達(dá)。
　　3.采用營(yíng)養(yǎng)液栽培對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株特性鑒定。在低磷(10μMPi)和正常磷（1000μM）培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片、莖和根部的有效磷和全磷含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因(NT)植株。在低磷條件下，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，沒(méi)有出現(xiàn)缺磷癥狀，并且株高、根長(zhǎng)、根部鮮重和干重、葉面積及產(chǎn)量