半夏重要功能基因遺傳轉化體系的建立.pdf

1、半夏Pinelliaternata（Thunb.）Briet.為天南星科半夏屬多年生宿根草本植物，以塊莖入藥，首載于《神農本草經(jīng)》，是一種重要的中藥材。半夏在生產栽培上存在一系列問題，例如在氣溫高于30℃時半夏地上部分隨即枯萎，俗稱“倒苗”。倒苗縮短了半夏的生長期，嚴重影響了半夏的產量。在生產技術上，篩選出與半夏栽培問題相關的基因，如抗高溫、抗旱、抗蟲、抗除草劑基因等，通過農桿菌介導的轉基因技術，將相關基因導入半夏植株內，并培育出具有相

2、應抗性的半夏苗，從而解決當前半夏資源短缺和品質低的問題。轉基因技術以目的性強、周期短等優(yōu)點為半夏優(yōu)良品種的選育開辟了一條新途徑。同時，對半夏的長期研究可知，半夏中也含有一些重要的功能基因，如抗高溫倒伏基因、半夏凝集素基因等，可將這些新型基因轉入煙草等其他模式植物中，驗證其基因功能，為分子育種和品種創(chuàng)新提供基因資源。目前，關于半夏轉基因技術體系報道較少，而開展轉基因研究的前提是首先建立高效的遺傳轉化體系，國內對半夏的研究，多以葉片、葉柄和

3、塊莖作為研究對象。
　　本課題利用植物組織培養(yǎng)技術和現(xiàn)代分子生物學的知識及手段，建立高效的半夏遺傳轉化再生體系，根據(jù)當前的情況篩選出一些重要的功能基因，并通過根癌農桿菌介導法法及PCR等手段，獲得具有相應抗性的半夏的轉基因試管苗，并驗證其基因的功能。主要研究結果如下：
　?。?）培育出優(yōu)質的半夏試管苗，建立高效的半夏遺傳轉化再生體系。半夏葉柄及塊莖再生體系的研究已非常成熟，而葉片再生體系的建立至今研究卻很少，所以本實驗再生體

4、系的研究主要針對的是葉片。葉片在培養(yǎng)20d后，在6-BA濃度為1.5mg·L-1，IAA濃度為1.5mg·L-1，TDZ濃度為0.5mg·L-1這個梯度的半夏葉片再生形成試管小塊莖的能力最強。此外研究表明，葉片的面積較大，比較容易侵染；而葉柄和塊莖再生能力則較強、較快，所以應根據(jù)實際情況分別進行。
　?。?）選取對半夏生長具有重要作用的高溫基因，如小熱激蛋白基因（sHSP），作為本試驗的目的基因。
　　（3）構建載體并與目的

5、基因進行體外重組。構建載體的時候，通常應有篩選基因和報告基因的存在，以便于操作。此外還應含有35S強啟動子，以利于目的基因的順利表達。本實驗所用的載體為PBI121，含有Kan抗性基因和gus報告基因。利用軟件PrimerPremier5分析目的基因sHSP，發(fā)現(xiàn)sHSP適合的酶切位點為BamH1GGATCC或者Xba1TCTAGA。分別用限制性內切酶BamH1或Xba1與sHSP和載體質粒同時進行酶切反應，酶切液分別混合后加入T4連接

6、酶繼續(xù)反應。將最終的產物PCR并電泳或者生工測序，構建出我們需要的pBI121-sHSP重組質粒。
　?。?）由于根癌農桿菌EHA105利于單子葉植株的轉化，將重組質粒導入EHA105中，然后通過抗性篩選、PCR、生工測序等手段篩選出含有相應目的質粒的菌株。本實驗以半夏葉柄作為研究模型，不經(jīng)過預培養(yǎng)階段，功率50HZ超聲波輔助處理5min，直接用濃度A600nm＝0.5-0.6的根癌農桿菌菌液同時含AS40-80mg·L-1侵染半