半夏重要功能基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、半夏Pinelliaternata（Thunb.）Briet.為天南星科半夏屬多年生宿根草本植物，以塊莖入藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一種重要的中藥材。半夏在生產(chǎn)栽培上存在一系列問題，例如在氣溫高于30℃時(shí)半夏地上部分隨即枯萎，俗稱“倒苗”。倒苗縮短了半夏的生長(zhǎng)期，嚴(yán)重影響了半夏的產(chǎn)量。在生產(chǎn)技術(shù)上，篩選出與半夏栽培問題相關(guān)的基因，如抗高溫、抗旱、抗蟲、抗除草劑基因等，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將相關(guān)基因?qū)氚胂闹仓陜?nèi)，并培育出具有相

2、應(yīng)抗性的半夏苗，從而解決當(dāng)前半夏資源短缺和品質(zhì)低的問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)以目的性強(qiáng)、周期短等優(yōu)點(diǎn)為半夏優(yōu)良品種的選育開辟了一條新途徑。同時(shí)，對(duì)半夏的長(zhǎng)期研究可知，半夏中也含有一些重要的功能基因，如抗高溫倒伏基因、半夏凝集素基因等，可將這些新型基因轉(zhuǎn)入煙草等其他模式植物中，驗(yàn)證其基因功能，為分子育種和品種創(chuàng)新提供基因資源。目前，關(guān)于半夏轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系報(bào)道較少，而開展轉(zhuǎn)基因研究的前提是首先建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，國(guó)內(nèi)對(duì)半夏的研究，多以葉片、葉柄和

3、塊莖作為研究對(duì)象。
　　本課題利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)的知識(shí)及手段，建立高效的半夏遺傳轉(zhuǎn)化再生體系，根據(jù)當(dāng)前的情況篩選出一些重要的功能基因，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法法及PCR等手段，獲得具有相應(yīng)抗性的半夏的轉(zhuǎn)基因試管苗，并驗(yàn)證其基因的功能。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）培育出優(yōu)質(zhì)的半夏試管苗，建立高效的半夏遺傳轉(zhuǎn)化再生體系。半夏葉柄及塊莖再生體系的研究已非常成熟，而葉片再生體系的建立至今研究卻很少，所以本實(shí)驗(yàn)再生體

4、系的研究主要針對(duì)的是葉片。葉片在培養(yǎng)20d后，在6-BA濃度為1.5mg·L-1，IAA濃度為1.5mg·L-1，TDZ濃度為0.5mg·L-1這個(gè)梯度的半夏葉片再生形成試管小塊莖的能力最強(qiáng)。此外研究表明，葉片的面積較大，比較容易侵染；而葉柄和塊莖再生能力則較強(qiáng)、較快，所以應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況分別進(jìn)行。
　?。?）選取對(duì)半夏生長(zhǎng)具有重要作用的高溫基因，如小熱激蛋白基因（sHSP），作為本試驗(yàn)的目的基因。
　　（3）構(gòu)建載體并與目的

5、基因進(jìn)行體外重組。構(gòu)建載體的時(shí)候，通常應(yīng)有篩選基因和報(bào)告基因的存在，以便于操作。此外還應(yīng)含有35S強(qiáng)啟動(dòng)子，以利于目的基因的順利表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)所用的載體為PBI121，含有Kan抗性基因和gus報(bào)告基因。利用軟件PrimerPremier5分析目的基因sHSP，發(fā)現(xiàn)sHSP適合的酶切位點(diǎn)為BamH1GGATCC或者Xba1TCTAGA。分別用限制性內(nèi)切酶BamH1或Xba1與sHSP和載體質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切液分別混合后加入T4連接

6、酶繼續(xù)反應(yīng)。將最終的產(chǎn)物PCR并電泳或者生工測(cè)序，構(gòu)建出我們需要的pBI121-sHSP重組質(zhì)粒。
　　（4）由于根癌農(nóng)桿菌EHA105利于單子葉植株的轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入EHA105中，然后通過抗性篩選、PCR、生工測(cè)序等手段篩選出含有相應(yīng)目的質(zhì)粒的菌株。本實(shí)驗(yàn)以半夏葉柄作為研究模型，不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)階段，功率50HZ超聲波輔助處理5min，直接用濃度A600nm＝0.5-0.6的根癌農(nóng)桿菌菌液同時(shí)含AS40-80mg·L-1侵染半