蘋果砧木遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化與rolB基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、由于矮化密植具有早果、豐產(chǎn)等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外果樹，特別是蘋果生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。目前，在蘋果生產(chǎn)中，樹體矮化主要是通過選育矮密品種和采用矮化砧木來達到致矮目的，其中矮化砧是最理想的辦法。蘋果半矮化中間砧GM256具有矮化、抗寒、抗旱、抗鹽堿等優(yōu)良特征，由于生根困難，只能用于做矮化中間砧，丟掉了抗旱、抗鹽堿等優(yōu)良性狀。轉(zhuǎn)基因技術為蘋果矮化砧的遺傳改良開辟了一條新途徑。利用轉(zhuǎn)基因技術將ro1B基因?qū)胩O果矮化砧GM256中，極有希望獲得矮化、

2、抗寒、抗旱、抗鹽堿、扦插易生根，適于矮化密植的砧木新品種。 由于蘋果離體再生困難，極大限制了蘋果的轉(zhuǎn)基因改良。本試驗從蘋果矮化砧木品種M9和GM256組織培養(yǎng)體系的研究著手，優(yōu)化蘋果矮化砧的遺傳轉(zhuǎn)化體系，力爭建立GM256和M9的遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要取得以下研究結(jié)果： 1.穩(wěn)定、高效的腋芽增殖體系研究由建立無菌體系開始，對影響初代培養(yǎng)的因素進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在新梢還未抽生前，最佳的接芽狀態(tài)是待側(cè)芽已露出4～5片小葉時接

3、種；新梢快速生長期(4-5月)是最佳的取材時期；采用綜合防治的方法即在初代培養(yǎng)基中附加0.1％的活性炭，同時結(jié)合連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體，黑暗培養(yǎng)，有效防止了木本植物組織培養(yǎng)當中普遍存在的褐化現(xiàn)象。 同時發(fā)現(xiàn)，GM256生長點伸長生長困難，而M9在BN2(MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L)培養(yǎng)基中可形成帶有明顯莖節(jié)的植株。以M9帶單芽或雙芽的莖段為外植體，通過正交試驗篩選出適宜的腋芽分化培養(yǎng)基FH8(MS+BA5.0mg/

4、L+NAA0.02mg/L)。將帶腋芽莖段先在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后將其轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基中促進芽的生長，腋芽分化率可達到98％，增殖倍數(shù)為5.1。較大的芽被切離母體單獨培養(yǎng)，將莖段剩余部分作繼代培養(yǎng)，繼代3次后仍有芽不斷分化，增殖倍數(shù)又可提高，是一種較優(yōu)的增殖途徑。 2.不同因素對蘋果離體葉片再生的影響(1)激素對再生的影響：細胞分裂素是影響葉片再生頻率的重要因子。通過設計細胞分裂素和生長素組成不同的激素組合，研究了激素對葉

5、片組織再生的影響。使用細胞分裂素BA與生長素NAA組合時，葉片可膨大，隨BA濃度提高，葉片產(chǎn)生愈傷組織的量增加；使用KT與NAA組合時，葉片只是膨大，變脆，無愈傷組織的生成。而將M9葉片培養(yǎng)在BK3(MS+BA1.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L)分化培養(yǎng)基中，獲得16.7％的再生頻率。細胞分裂素TDZ對誘導蘋果離體葉片再生最有效。M9葉片在適宜的分化培養(yǎng)基MT3(MS+TDZ3.0mg/L+N

6、AA0.5mg/L)中獲得37.6％的再生頻率，而GM256葉片未再生，這也許與它的基因型有關。在此培養(yǎng)基中再生出的不定芽不易伸長生長，且葉片形態(tài)發(fā)生改變，但將不定芽切分后轉(zhuǎn)移到含有BA的培養(yǎng)基中，不定芽可恢復正常。 (2)糖對葉片再生的影響：糖在組織培養(yǎng)中既是碳素來源和能量物質(zhì)，又是重要的滲透壓調(diào)節(jié)劑，對于離體組織的形態(tài)發(fā)生有著特殊作用。山梨醇和蔗糖適宜的濃度都是30g/L。在30g/L的濃度下，兩種糖對葉片再生頻率的影響無差

7、異，但葉片在附加山梨醇的培養(yǎng)基中存活時間長，平均每葉再生的芽數(shù)多，但再生的不定芽矮小，生長緩慢。可見，山梨醇對不定芽的分化有利，而蔗糖對不定芽的生長有利。 (3)其他因素對葉片再生的影響：研究葉片放置于培養(yǎng)基中的方向?qū)θ~片再生的影響時，認為正放與反放對再生頻率的影響不大，不定芽多產(chǎn)生于葉片中脈切口處與葉柄基部，葉片正放對不定芽的生長有利；葉片切割方式以整葉劃痕即垂直主葉脈橫劃三刀，但不切斷葉緣的方式獲得最好的再生效果；葉片被切割

8、成葉塊，產(chǎn)生過多的愈傷組織，再生頻率降低；以叢生芽葉片再生出的不定芽的葉片為外植體，獲得的再生頻率高于叢生芽葉片。 3.Ro1B基因的轉(zhuǎn)化(1)抗生素的敏感度實驗：通過試驗發(fā)現(xiàn)，蘋果葉片對卡那霉素特別敏感，5mg/L足以抑制葉片再生；培養(yǎng)基中附加卡那霉素40mg/L時，就可抑制高度為2～3厘米的組培苗生長，使整株植株黃化，莖尖萎蔫。 (2)將高度在2～3cm的無根植株預培養(yǎng)在含生長素的培養(yǎng)基(1/2MS+IBA0.2mg