山新楊高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及蒙古柳FOX山新楊抗性植株的獲得.pdf

1、楊樹(shù)是木本植物的模式植物，其遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理、轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化范圍已有深入研究，并取得了較大的發(fā)展，同時(shí)也獲得了不同品種的轉(zhuǎn)基因植株，但在楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，實(shí)際上是在進(jìn)行大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，而得到了的少數(shù)幾個(gè)轉(zhuǎn)化子。FOX-Hunting System技術(shù)，即Full-length cDNA Over-eXpressor gene Hunting System（全長(zhǎng)cDNA高效表達(dá)功能基因探索系統(tǒng)），該方法通過(guò)把全長(zhǎng)cDNA高效率地導(dǎo)入植物中

2、，使其基因過(guò)量表達(dá)并導(dǎo)致表型發(fā)生變化，達(dá)到明確基因功能的目的。本文為將FOX hunting system技術(shù)應(yīng)用在木本植物楊樹(shù)中，建立高效率的楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系具有現(xiàn)實(shí)意義。成功的植物基因轉(zhuǎn)化首先需要依賴(lài)一個(gè)良好的再生體系的建立，而理想受體系統(tǒng)的建立則與植物的組織培養(yǎng)分不開(kāi)。本文以山新楊(Populus davidiana Dode×Populus bollenaLauche)葉片為實(shí)驗(yàn)材料，建立了高效的山新楊再生體系，在此基礎(chǔ)上，建立

3、了一個(gè)高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。使用建立的山新楊高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將已構(gòu)建的蒙古柳cDNA農(nóng)桿菌表達(dá)文庫(kù)，轉(zhuǎn)入山新楊中，獲得了大量的蒙古柳FOX山新楊抗性植株，并對(duì)獲得的大量的抗性植株進(jìn)行耐鹽堿性的初步篩選，獲得了較為耐鹽堿的轉(zhuǎn)基因品種，為在木本植物中利用FOX hunting system技術(shù)篩選功能基因打下基礎(chǔ)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　建立了一個(gè)高效的山新楊再生體系，為山新楊的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
　　(1)以2％的NaClO

4、作為消毒劑，消毒不同的時(shí)間，篩選較好的消毒時(shí)間，結(jié)果顯示使用2％的NaClO作為消毒劑，消毒15min可以達(dá)到較好的消毒效果。
　　(2)使用6-BA(0.1，0.3，0.5mg/L)和NAA(0.01，0.03，0.05，0.08，0.1mg/L)兩種激素進(jìn)行不同濃度的組合，篩選出具有較高分化率的山新楊葉片分化培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，山新楊葉片在1/2 MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.08mg/L分化培養(yǎng)基上，具有最高的分化率

5、，分化率達(dá)到90％以上。
　　(3)將分化出叢生芽的葉片外植體接種于含有6-BA（0.3，0.5，0.8 mg/L）和NAA(0.05，0.1，0.15 mg/L)兩種激素進(jìn)行不同濃度組合的壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗，以提高生根率，篩選得到較優(yōu)的壯苗培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳壯苗培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1mg/L。
　　(4)我們將分化出的叢生芽分成單芽，接種于含有不同濃度的NAA(0.1，0.2，

6、0.25，0.3，0.4 mg/L)培養(yǎng)基中，篩選較優(yōu)的生根培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，山新楊芽在1/2 MS+NAA0.25mg/L培養(yǎng)基中生根，生根率為100％，且根系粗細(xì)適中，分根多且根系長(zhǎng)勢(shì)快。
　　(5)將在培養(yǎng)基中生根長(zhǎng)大的山新楊組培苗進(jìn)行煉苗和移栽，獲得盆栽山新楊植株，移栽成活率達(dá)到90％以上。
　　以高效的山新楊再生體系為基礎(chǔ)，建立了一個(gè)高效的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，為獲得大量的cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)基因植株提供成熟的技術(shù)。

7、>　　(1)卡那霉素(Kan)作為遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的篩選標(biāo)記，對(duì)Kan的不同濃度進(jìn)行篩選，選擇較適合的濃度應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30mg/L作為篩選培養(yǎng)山新楊葉片分化的篩選壓較為合適;40mg/L作為山新楊生根篩選的適宜濃度。頭孢噻虧鈉(Cef)作為遺傳轉(zhuǎn)化中的抑菌劑，可以抑制根癌農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但也影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明選用200 mg/L的Cef作為篩選山新楊抗性苗的抑菌劑濃度較為合適。
　　(2)對(duì)不同菌

8、液濃度(OD600=0.6，0.8，1.0，1.2)和侵染時(shí)間(10min.20min30min,40min)對(duì)山新楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品表面的農(nóng)桿菌的附著情況進(jìn)行了掃描電鏡的觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中菌液濃度選定在0.8-1.0之間，侵染時(shí)間在20-30min為適宜。
　　(3)對(duì)乙酰丁香酮(AS)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中所起的效果做了研究，結(jié)果顯示在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率存在

9、一定的影響，但效果不明顯。
　　(4)在上述(1)-(3)中篩選的最優(yōu)條件處理下，研究了不同葉齡(30d，60d，90d)的山新楊葉片對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，并對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品表面農(nóng)桿菌的附著情況和內(nèi)部農(nóng)桿菌的侵入情況進(jìn)行了掃描電鏡和透射電鏡的觀察，篩選出了適合于楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的葉片外植體年齡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30d大小的葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體可明顯提高山新楊的遺傳轉(zhuǎn)化效率。掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到30d大小的葉片表面在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中所附著的農(nóng)

10、桿菌的量較60d，90d的葉片外植體多。透射電鏡的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30d大小的葉片作為外植體時(shí)，葉片內(nèi)部侵入的農(nóng)桿菌的數(shù)量均多于60d和90d的葉片外植體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用30d大小的山新楊葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，可提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。綜上優(yōu)化因素，遺傳轉(zhuǎn)化效率高達(dá)30％以上。本部分實(shí)驗(yàn)使用pBI-121-MD-GFP基因作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的指示報(bào)告基因，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，分化出的芽可在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，激發(fā)出熒光。并選擇部分轉(zhuǎn)基因植物

11、進(jìn)行Southern Blot和Northern Blot實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因轉(zhuǎn)入了山新楊中并得到了表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)使用建立的高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將已構(gòu)建得到的蒙古柳(Salix linearistioularisHao) cDNA農(nóng)桿菌文庫(kù)轉(zhuǎn)入到山新楊中，獲得了218株蒙古柳FOX山新楊抗性植株。同時(shí)將抗性植株進(jìn)行耐鹽堿性的初步篩選，初步獲得了2個(gè)抗NaCl，2個(gè)抗NaHCO3的山新楊抗性品種。并將具有抗性的植株進(jìn)行移栽，以備