殼聚糖及殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球抗大鼠PCP的研究.pdf

1、背景和目的：
　　肺孢子菌(pneumocystis)可寄生于有免疫缺陷的人和多種哺乳動(dòng)物肺組織內(nèi)，引起肺孢子菌性肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）。在人類PCP經(jīng)常發(fā)生于AIDS、長期接受抗腫瘤藥物和免疫抑制劑的患者。隨著此類患者的增多，PCP患病率呈增多趨勢，因此受到越來越多的關(guān)注。
　　目前PCP主要依靠藥物治療，常用的藥物有磺胺甲基異惡唑-甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim-Sulfam

2、ethoxazole，Tmp-Smz)、潘他米丁、氨苯砜和阿托伐醌等。但是這些藥物的治療效果欠佳，并且存在不同程度的副作用，并隨之出現(xiàn)了對這些藥物的耐受性。因此研究新的抗PCP的藥物變的日益迫切。
　　殼聚糖為一種多聚糖，通常是有甲殼素通過脫乙酰作用獲得，殼聚糖制取方便并且具有好的生物學(xué)相容性、生物可降解性和無毒性。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有抗細(xì)菌和真菌的作用。酵母多糖為來自于釀酒酵母，可以作為Dectin-1受體的激活劑，從而起到免疫調(diào)

3、節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)Dectin-1受體具有抵抗肺孢子菌感染的作用，而PCP患者出現(xiàn)Dectin-1受體表達(dá)下調(diào)，酵母多糖具有上調(diào)Dectin-1受體從而增強(qiáng)患者抗肺孢子菌感染的作用。但是目前為止沒有將殼聚糖和酵母多糖應(yīng)用于抗PCP研究的報(bào)道。本研究擬從殼聚糖具有抗菌作用和酵母多糖具有升高Dectin-1受體的作用為切入點(diǎn)，同時(shí)利用殼聚糖-酵母多糖微球的緩釋作用，對其抗大鼠PCP的效果進(jìn)行研究，此次研究將為殼聚糖和酵母多糖治療PCP提供理論

4、依據(jù)。
　　本研究目的在于在大鼠PCP模型體內(nèi)探討殼聚糖及殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP的治療效果，并探討相關(guān)的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.大鼠PCP模型的構(gòu)建和分組
　　通過每周兩次給大鼠后腿肌注地塞米松磷酸鈉的方式構(gòu)建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型構(gòu)建成功后，隨機(jī)將大鼠分為以下7組:免疫正常組、0.5％殼聚糖-免疫正常組、PCP模型組、0.1％殼聚糖組、0.5％殼聚糖組、0.2％乙酸組和Tmp-Smz組

5、（Tmp0.0215 mg/g和Smz0.11 mg/g體重）。
　　2.在大鼠PCP模型中研究0.5％殼聚糖對PCP大鼠體重增加量、肺重、肺重/體重(lung weight/body weight，LW/BW)比率和存活率的影響
　　藥物治療開始前和開始后分別對大鼠進(jìn)行稱重，處死大鼠后稱量大鼠肺重。通過對大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，評估藥物的治療效果。
　　3.在大鼠PCP模型中研究0.5％殼

6、聚糖對PCP大鼠肺組織的影響
　　取大鼠肺組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，通過光鏡觀察各組大鼠肺組織變化和炎癥浸潤。
　　4.掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察各組肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)改變
　　取大鼠肺組織通過SEM和TEM觀察藥物對肺孢子菌的超

7、微結(jié)構(gòu)破壞。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量
　　取大鼠肺組織提取總RNA，定量PCR檢測肺組織內(nèi)肺孢子菌的HSP70 mRNA表達(dá)量。
　　6. ELISA法檢測各組大鼠血清內(nèi)IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子的含量
　　采集大鼠腹主動(dòng)脈血，提取血清。用ELISA法檢測藥物對血清內(nèi)IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子含量的影響。
　　7.使用流式

8、細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的含量
　　采集大鼠腹主動(dòng)脈血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物對大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的影響。
　　8.大鼠PCP模型的構(gòu)建和分組
　　通過每周兩次給大鼠后腿肌注地塞米松磷酸鈉的方式構(gòu)建大鼠PCP模型。PCP大鼠模型構(gòu)建成功后，隨即將大鼠分為以下7組:免疫正常組、PCP模型組、0.5％殼聚糖組、0.5％殼聚糖+0.9％氯化鈉組、0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組

9、、0.5％殼聚糖+1％酵母多糖組、0.8％殼聚糖-酵母多糖微球組。
　　9.在PCP大鼠體內(nèi)研究0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影響
　　治療開始前和開始后分別對大鼠進(jìn)行稱重，處死大鼠后稱量大鼠肺重。通過對大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的研究，評估藥物的治療效果。
　　10.在PCP大鼠體內(nèi)研究0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織的影響<

10、br>　　取大鼠肺組織進(jìn)行HE染色，通過光鏡觀察各組大鼠肺組織改變和炎癥浸潤。
　　11. TEM觀察各組肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)改變
　　取大鼠肺組織通過TEM觀察藥物對肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)破壞。
　　12.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1和TLR-4受體mRNA表達(dá)量
　　取大鼠肺組織提取RNA，定量PCR檢測藥物對大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1和TLR-4受體mRNA表達(dá)量的影響。
　　1

11、3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量
　　切取大鼠肺組織提取總RNA，定量PCR檢測肺孢子菌的HSP70mRNA表達(dá)量。
　　14. ELISA法檢測大鼠血清內(nèi)細(xì)胞因子的含量
　　采取大鼠腹主動(dòng)脈血，提取血清。用ELISA法觀察藥物對血清內(nèi)IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-y、MCP-1、IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子含量的影響。
　　結(jié)果：

12、　　1.0.5％殼聚糖對PCP大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影響
　　0.5％殼聚糖治療后大鼠體重增加量明顯高于PCP模型組、0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組;0.5％殼聚糖治療后大鼠肺重和LW/BW比率明顯低于PCP模型組、0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組。0.5％殼聚糖治療后大鼠存活率高于PCP模型組和0.2％乙酸組。
　　2.0.5％殼聚糖對PCP大鼠肺組織的影響
　　0.5％的殼聚糖治療后，PC

13、P大鼠肺組織內(nèi)炎細(xì)胞和巨噬細(xì)胞明顯減少，肺泡腔內(nèi)無泡沫樣物質(zhì)，而PCP模型組、0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組肺組織內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤并可見泡沫樣物質(zhì)形成。
　　3.0.5％殼聚糖對肺孢子菌超微結(jié)構(gòu)的影響
　　0.5％的殼聚糖治療后，電鏡下肺孢子菌的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的破壞，可見核固縮、胞膜表面結(jié)構(gòu)不完整。
　　4.0.5％殼聚糖對PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量的影響
　　0.5％的殼聚糖

14、治療后，PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量明顯低于PCP模型組，0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組。
　　5.0.5％殼聚糖對PCP大鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子含量的影響
　　0.5％的殼聚糖治療后PCP大鼠血清內(nèi)IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子的含量明顯高于PCP模型組，0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組，而TNF-α細(xì)胞因子的含量明顯低于PCP模型組，0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組。<

15、br>　　6.0.5％殼聚糖對PCP大鼠動(dòng)脈血內(nèi)CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的影響
　　0.5％的殼聚糖治療后與PCP模型組、0.2％乙酸組和0.1％殼聚糖組相比明顯提高了PCP大鼠動(dòng)脈血內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞含量，與PCP模型組和0.2％乙酸組相比降低了CD8+T淋巴細(xì)胞含量。
　　7.0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠體重增加量、肺重、LW/BW比率和存活率的影響
　　0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療

16、后與PCP模型組、0.5％殼聚糖組和0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組相比明顯提高了PCP大鼠的體重增加量，并且降低了PCP大鼠的肺重和LW/BW比率。0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后大鼠存活率高于模型組。
　　8.0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織的影響
　　0.8％的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后與PCP模型組、0.5％殼聚糖組和0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組相比PCP大鼠肺組織內(nèi)炎細(xì)胞明顯減少

17、。
　　9.0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1和TLR-4受體mRNA表達(dá)量的影響
　　0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后與PCP模型組、0.5％殼聚糖組和0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組相比明顯提高了PCP大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1受體mRNA和降低了PCP大鼠肺部TLR-4受體mRNA的表達(dá)量。
　　10.0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP7

18、0 mRNA表達(dá)量的影響
　　0.8％的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后，PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量明顯低于PCP模型組，0.5％殼聚糖組和0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組。
　　11.0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球?qū)CP大鼠血清內(nèi)細(xì)胞因子的影響
　　0.8％的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后PCP大鼠血清內(nèi)IL-1β、IL-4、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子的含量明顯高于PCP模型組、0.

19、5％殼聚糖組和0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組，而IL-1α、IL-6和TNF-α細(xì)胞因子的含量明顯低于PCP模型組、0.5％殼聚糖組和0.5％殼聚糖+0.5％酵母多糖組。0.8％的殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球治療后PCP大鼠血清內(nèi)MCP-1細(xì)胞因子的含量明顯高于PCP模型組，IL-2細(xì)胞因子的含量明顯低于PCP模型組。
　　結(jié)論：
　　1.0.5％的殼聚糖可以減少PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量、降低LW

20、/BW比率、減輕肺部炎癥浸潤，并且能夠增加血清內(nèi)IFN-γ、IL-10細(xì)胞因子含量和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，減少CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量和TNF-α細(xì)胞因子含量，并且還能夠引起肺孢子菌超微結(jié)構(gòu)破壞。
　　2.0.8％殼聚糖-酵母多糖復(fù)合微球可以減少PCP大鼠肺組織內(nèi)肺孢子菌HSP70 mRNA表達(dá)量、TLR-4受體mRNA表達(dá)量、降低LW/BW比率、減輕肺部炎癥浸潤，并且能夠增加PCP大鼠肺組織內(nèi)Dectin-1受體mRNA表達(dá)量和