新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——生物素化脂質(zhì)體SPIO納米微粒的初步制備及評(píng)價(jià).pdf

1、惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的最嚴(yán)重疾病之一,每年死于惡性腫瘤的患者高達(dá)數(shù)百萬(wàn),造成勞動(dòng)力的巨大損失和社會(huì)資源的驚人消耗,同時(shí)給患者及其家屬帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力。因此惡性腫瘤已經(jīng)成為全人類(lèi)共同關(guān)注的重大課題。目前,具有腫瘤靶向超順磁氧化鐵納米微粒由于其在MRI診斷、熱療及靶向給藥中潛能,是目前靶向制劑研究中很熱門(mén)的課題。本課題嘗試制備能逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬作用的主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——生物素標(biāo)記的PEG化脂質(zhì)體SPIO(Biotin

2、-PEG-liposome SPIO)納米微粒,設(shè)想利用“三步法”抗體預(yù)定位技術(shù)的靶向定位作用及生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system,BAS)的生物放大效應(yīng),提高生物素化單克隆抗體和生物素標(biāo)記的脂質(zhì)體SPIO的結(jié)合量,提高腫瘤局部MR對(duì)比劑濃度,增加信號(hào)強(qiáng)化程度,達(dá)到提高M(jìn)R分子免疫成像的敏感性的目的,為腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的早期診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)與術(shù)后纖維瘢痕的鑒別診斷等探索新的途徑。本課題還對(duì)所制備的Biotin-PE

3、G-liposomeSPIO納米微粒的理化特性、生物素活性、細(xì)胞毒性及在體內(nèi)外抗巨噬細(xì)胞吞噬作用與腫瘤靶向性MR成像效果等進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。
　　 第一章生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性腿對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的制備及其理化生物特性的初步研究
　　 研究目的：
　　 制備新型生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——生物素標(biāo)記的PEG化脂質(zhì)

4、體SPIO(Biotin-PEG-liposome SPIO)納米微粒,并對(duì)其理化性質(zhì)與細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定和初步評(píng)價(jià),以判斷其臨床應(yīng)用的可能性與前景。
　　 第一節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO的初步制備
　　 材料及方法：
　　 1月桂酸穩(wěn)定的超順磁性氧化鐵(SPIO)納米微粒的制備:
　　 采用化學(xué)共沉淀法制備SPIO,并在

5、堿性條件下與月桂酸反應(yīng)形成月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒。
　　 2 Biotin-PEG-liposome納米微粒的制備:
　　 按摩爾比20:1精密稱(chēng)取一定量DSPG、DSPE-PEG2000-Biotin,采用薄膜分散法合成Biotin-PEG-liposome納米微粒。
　　 3 Biotin-PEG—liposome SPIO納米微粒的制備:
　　 將上述月桂酸穩(wěn)定的SPIO及Biotin-PEG

6、-liposome以一定比例混合,加入TES緩沖液(5mM,PH=7.0),透析3天,過(guò)凝膠柱去除過(guò)大的脂質(zhì)體及游離的磷脂,制得Biotin—PEG—liposome包被的SPIO納米微?！狟iotin—PEG-liposomeSPIO。
　　 第二節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——Biotin—PEG—liposome SPIO的理化性質(zhì)測(cè)定
　　 材料及方法：
　　 1月桂酸穩(wěn)

7、定的SPIO、Biotin—PEG—liposome納米微粒、Biotin—PEG-liposomeSPIO納米微粒透射電子顯微鏡下形態(tài)觀察:
　　 取少量無(wú)月桂酸穩(wěn)定的SPIO及月桂酸穩(wěn)定的SPIO懸濁液用去離子水稀釋后,滴少許于敷有支撐膜的銅網(wǎng)上,靜置約5分鐘后,用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體,紅外燈下靜置干燥后,置透射電子顯微鏡下觀察納米微粒子的大小和形態(tài)。
　　 各取一份Biotin-PEG-liposome、

8、Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液用去離子水稀釋后,滴于有支撐膜的銅網(wǎng)上,靜置約5分鐘后,用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體；用磷鎢酸約20μl負(fù)染約30～60s,再用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體,紅外燈下靜置干燥后,置透射電子顯微鏡下觀察。
　　 2月桂酸穩(wěn)定的SPIO、Biotin-PEG—liposome納米微粒及Biotin-PEG-liposomeSPIO納米微粒粒徑及分布的測(cè)定:
　

9、　 用Malvern Zetasizer3000HS激光散射粒度分析和電位測(cè)定儀測(cè)定三種納米微粒的粒徑及分布:三種樣品各取5μl,用蒸餾水稀釋至測(cè)量杯中,放入樣品槽中測(cè)試。所選激光光源的波長(zhǎng)為633.0nm,測(cè)試溫度為25.00±0.05℃。
　　 3月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒和Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒中鐵含量的測(cè)定:
　　 用鄰二氮菲法測(cè)定月桂酸穩(wěn)定的SPIO和Biotin-PEG-

10、liposome SPIO納米微粒懸濁液中鐵的含量,在所選最大吸收波長(zhǎng)λmax=511.5nm處,測(cè)定溶液的吸光光度值,根據(jù)Fe含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中鐵含量。
　　 4 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒中脂質(zhì)濃度的測(cè)定:
　　 用紫外分光光度計(jì)法在所選最大吸收波長(zhǎng)λmax=819nm處,測(cè)定溶液的吸光度,根據(jù)脂質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中脂質(zhì)的含量。
　　 5 Biotin-PEG-lip

11、osome SPIO納米微粒中生物素含量的測(cè)定:
　　 采用Quant TagTM Biotin Kit生物素試劑盒精確測(cè)量并計(jì)算單位質(zhì)量納米微粒的生物素含量。
　　 6 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的X-射線粉末衍射(XRD)分析:
　　 取真空干燥的Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒研細(xì),置于D/Max-ⅢA X-射線粉末(多晶)衍射儀中,采用鎳過(guò)濾的C(u)

12、Kα放射線,以40/min的速度掃描,掃描范圍是20為200°～900°。將所得的圖譜與國(guó)際粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)出版的PDF卡片比較,以此來(lái)確定樣品所具備的晶體結(jié)構(gòu)。
　　 7 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的磁化率測(cè)定:
　　 精密稱(chēng)取真空干燥后的Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒適量,放置于美國(guó)Quantum Design公司物理綜合測(cè)量系統(tǒng)(PPMS-9)中,測(cè)定溫度為

13、300K,隨著外磁場(chǎng)從-4000～4000 Oe的變化,測(cè)定納米微粒磁矩的變化情況,并繪制對(duì)應(yīng)的磁性曲線。磁化率的大小可以反應(yīng)SPIO的磁響應(yīng)能力,當(dāng)外加磁場(chǎng)一定時(shí),磁矩越大表明樣品的磁響應(yīng)能力越強(qiáng)。
　　 8 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒T2值的測(cè)定及T2弛豫率的計(jì)算:
　　 將Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液稀釋,并按鐵濃度為0.04、0.06、0.08、0.

14、10、0.12、0.14、0.16mmol/L分裝于7只試管中,置于塑料試管架上,在MR機(jī)器上進(jìn)行橫斷面掃描,采用8通道頭頸部聯(lián)合線圈,掃描序列采用T2map,隨后測(cè)量各個(gè)濃度試管中部4個(gè)層面的T2值,取其平均值,計(jì)算樣品的T2弛豫率,即含鐵濃度與1/T2直線方程的斜率。
　　 結(jié)果：
　　 1透射電子顯微鏡下月桂酸穩(wěn)定的SPIO、Biotin-PEG-liposome納米微粒、Biotin-PEG-liposome S

15、PIO納米微粒的形態(tài)大小:
　　 無(wú)月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒呈現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象,分散度較低。
　　 月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒呈類(lèi)圓形、大小均勻的黑色顆粒,較分散,僅有少許團(tuán)聚現(xiàn)象,電鏡下估算其平均粒徑約2～14nm。
　　 Biotin-PEG-liposome納米微粒復(fù)染后顯示為類(lèi)圓形白色空泡,表面光整平滑,分布較均勻,相互間無(wú)粘連,電子顯微鏡下估算其平均粒徑約5～15nm。
　　 Biotin

16、-PEG-liposome SPIO納米微粒負(fù)染后顯示為類(lèi)圓形殼核結(jié)構(gòu),核心為黑色顆粒狀,外包繞薄層白邊,電鏡下估算其平均粒徑約8～22nm。
　　 2月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒、Biotin-PEG-liposome納米微粒及Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的Malvern-3000HS激光粒度分析儀測(cè)定結(jié)果:
　　 月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒:強(qiáng)均粒徑di=123.1nm,峰面積:100％

17、,峰數(shù)為1；體均粒徑dv=70.7nm,峰面積:100％,峰數(shù)為1;數(shù)均粒徑dn=45.5nm,峰面積:100％,峰數(shù)為1；多分散系數(shù)為0.227。
　　 Biotin-PEG-liposome納米微粒:較小的強(qiáng)均粒徑di=43.0nm,峰面積:100％,峰數(shù)為2；較小的體均粒徑dv=43.0nm,峰面積:100％,峰數(shù)為2；較小的數(shù)均粒徑dn=42.7nm,峰面積:100％,峰數(shù)為2；多分散系數(shù)為0.23。
　　 Bi

18、otin-PEG-liposome SPIO納米微粒:強(qiáng)均粒徑di=132.5nm,峰面積:100％,峰數(shù)為1；體均粒徑dv=61.4m,峰面積:100％,峰數(shù)為1；數(shù)均粒徑dn=37.6nm,峰面積:100％,峰數(shù)為1；多分散系數(shù)為0.28。
　　 3月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒及Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的鐵含量測(cè)定結(jié)果:
　　 鐵含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.1997X+0.0037,R

19、2=0.9992,在0～2.0μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒懸濁液鐵含量為13.06mg/ml；Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液鐵含量為5.49mg/ml。
　　 4 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的脂質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果:
　　 脂質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=3.2842X+0.0203,R2=0.9993,在0～2.0μg/ml濃度范圍內(nèi)

20、線性關(guān)系良好。Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液脂質(zhì)濃度為S.66μg/ml。
　　 5 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的生物素含量測(cè)定結(jié)果:
　　 生物素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.032X-0.002,R2=0.997,在0.5～10.0 nmol/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液生物素含量為7.36nmo

21、l/ml。
　　 6 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的X線衍射物分析結(jié)果:
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的主要成份為面心立方尖晶石結(jié)構(gòu)的Fe3O4,且Fe3O4粒子的結(jié)晶狀態(tài)良好,表面PEG修飾的脂質(zhì)體包裹對(duì)SPIO的晶型沒(méi)有影響。
　　 7 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的磁化率測(cè)定結(jié)果:
　　 Biotin-PEG-

22、liposome SPIO納米微粒的矯頑力非常小,具有超順磁性；質(zhì)量飽和磁化強(qiáng)度為68.6 emu/g Fe。
　　 8 Biotin—PEG—liposome SPIO納米微粒懸濁液的T2值測(cè)定及T2弛豫率的計(jì)算
　　 結(jié)果:
　　 Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液鐵濃度(mmol/L)與1/T2的回歸方程為:Y=0.2842X-0.002,R2=0.9974。樣本的T2值隨著鐵濃

23、度的增加逐漸下降,T2弛豫率為0.2842×106mol-1·s-1,高于0.062×106 mol-1·s-1的最低標(biāo)準(zhǔn)。
　　 第三節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑--Biotin-PEG-liposome SPIO的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)
　　 材料及方法：
　　 1人正常肝細(xì)胞株L-O2細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng):
　　 從液氮罐中取出含L-O2細(xì)胞的凍存管,直接投入37℃恒溫

24、水浴箱,待融化后,離心5min,除去上清液后用含20％PBS的RPMI-1640培養(yǎng)液5 ml重新懸浮細(xì)胞后接種培養(yǎng)瓶,置入5％CO2,37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)>80％的融合度時(shí),胰酶消化2min左右,用吸管輕輕吹打細(xì)胞,直至貼壁細(xì)胞懸浮。
　　 2 MTT法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性:
　　 將L-O2細(xì)胞懸液接種于96孔板中(5×103個(gè)/孔),培養(yǎng)24h后分別加入未包被裸SPIO懸濁液及Biotin-PEG-lip

25、osome SPIO納米微粒懸濁液,濃度分別為每孔鐵含量為10μg、20μg、40μg、80μg、120μg、160μg和200μg,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以?xún)H含培養(yǎng)基者作為調(diào)零孔,以?xún)H含正常L—O2細(xì)胞者為正常對(duì)照孔。培養(yǎng)24h后,加入濃度為5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,繼續(xù)孵化4h,加入200μlDMSO,平板震蕩儀震蕩10min,在酶標(biāo)儀中測(cè)定490nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值),并計(jì)算細(xì)胞存活率,即(樣品孔的OD值-樣品對(duì)

26、照孔的OD值)/正常對(duì)照孔的OD值。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　 采用SPSS13.0軟件包,利用完全隨機(jī)分組兩因素析因設(shè)計(jì)法分析資料,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析,考察兩個(gè)處理因素對(duì)細(xì)胞毒性影響的差異是否有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:第一個(gè)因素是藥物(drug),有兩個(gè)水平(“未包被的裸SPIO(=1)”和“Biotin-PEG-liposome SPIO(=2)”)；第二個(gè)因素是培養(yǎng)基中鐵濃度,有6個(gè)水平(100μg/ml(=1)、20

27、0μg/ml(=2)、400μg/ml(=3)、600μg/ml(=4)、800μg/ml(=5)和1000μg/ml(=6))。P<0.05則認(rèn)為有顯著性意義。
　　 結(jié)果：
　　 隨著培養(yǎng)液中鐵濃度的增加,兩組L-O2細(xì)胞生存率均有下降的趨勢(shì)。未包被的裸SPIO被細(xì)胞吞噬后,毒性很大,高濃度時(shí)(1000μg Fe/孔)細(xì)胞生存率小于20％,其細(xì)胞毒性隨濃度變化顯著。Biotin-PEG-liposome SPIO組的

28、細(xì)胞毒性明顯低于未包被的裸SPIO組,高濃度時(shí)(1000μg Fe/孔)細(xì)胞生存率也在80％左右。這表明SPIO經(jīng)脂質(zhì)體包被后,細(xì)胞毒性明顯下降。兩種藥物對(duì)細(xì)胞毒性影響的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。鐵濃度對(duì)細(xì)胞毒性影響的差異亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本章采用三步法成功地合成了一種新型超順磁性氧化鐵納米微?！锼貥?biāo)記的PEG化脂質(zhì)體SPIO(Biotin-PEG-lip

29、osome SPIO),粒徑約8～22nm,大小較均勻,多分散性好,具有超順磁性及T2弛豫效應(yīng)；能夠滿足超小超順磁性氧化鐵納米微粒作為長(zhǎng)循環(huán)腫瘤靶向?qū)Ρ葎┑幕疽蟆?br>　　 2.本課題合成的Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的生物素含量高,為生物素-親和素系統(tǒng)介導(dǎo)的腫瘤靶向性MR顯像提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 3.本課題合成的Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的細(xì)胞毒性小,生物安全

30、性好,生物相容性佳,為臨床應(yīng)用提供了安全保障。
　　 第二章生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的體外及體內(nèi)抗單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬作用的初步評(píng)價(jià)
　　 研究目的：
　　 體外及體內(nèi)評(píng)價(jià)我們所制備的Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的抗單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬作用。
　　 第一節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介

31、導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO的巨噬細(xì)胞體外吞噬實(shí)驗(yàn)
　　 材料及方法：
　　 將凍存的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中,加含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)液適量,37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)24h；待細(xì)胞達(dá)到80-90％匯合后,胰酶消化,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上(每孔細(xì)胞數(shù)為5×105/ml),孵化24h后,用PBS液洗滌三遍,加入含

32、鐵量800μg Fe/ml的空白SPIO和Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒懸濁液的DMEM全培養(yǎng)液2ml,孵化24h后,再用PBS液洗滌三遍,以未加入SPIO溶液的細(xì)胞作為空白對(duì)照,每孔分別加入4％的多聚甲醛溶液1ml,固定20min后,加入2％亞鐵氰化鉀溶液和2％鹽酸(體積比2:1)的混合液1ml,37℃下孵育30min后,用PBS液洗三遍,于倒置顯微鏡下觀察,拍照比較RAW264.7細(xì)胞與含上述兩種納米微粒的

33、培養(yǎng)基孵化24h后,經(jīng)普魯士藍(lán)染色后顏色的差異。
　　 結(jié)果：
　　 未加入含鐵溶液的空白對(duì)照組與RAW264.7細(xì)胞孵育24h后,普魯士藍(lán)染色后,巨噬細(xì)胞未見(jiàn)任何藍(lán)染；與空白對(duì)照組相比,未包被的裸SPIO組與RAW264.7細(xì)胞孵育24h,普魯士藍(lán)染色后,巨噬細(xì)胞被染成亮藍(lán)色；而B(niǎo)iotin-PEG-liposomeSPIO組與RAW264.7細(xì)胞孵育24h,普魯士藍(lán)染色后,巨噬細(xì)胞只有少許被染成亮藍(lán)色,大部分呈淺藍(lán)色

34、。
　　 第二節(jié)生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO的健康裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)
　　 材料及方法：
　　 將12只健康裸鼠分為三組:空白對(duì)照組(n=4)、未包被裸SPIO組(n=4)、Biotin-PEG-liposome SPIO組(n=4)；經(jīng)尾靜脈分別緩慢注射0.05ml生理鹽水、未包被裸SPIO懸濁液以及Biotin-PEG—lipos

35、ome SPIO懸濁液(10mgFe/kg b.w.)。24h后行頸椎脫臼法處死裸鼠,并快速取其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟以及心臟組織,固定、包埋、蠟封、脫蠟后行普魯士藍(lán)染色觀察切片上藍(lán)染顆粒分布情況及數(shù)量,初步考察未包被的裸SPIO納米微粒及Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒在健康裸鼠體內(nèi)各主要器官的分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1)空白對(duì)照組普魯士藍(lán)染色:肝臟、脾臟、心臟、肺臟及腎臟各組織內(nèi)均未見(jiàn)

36、藍(lán)染鐵顆粒；
　　 2)未包被裸SPIO組普魯士藍(lán)染色:肝臟組織可見(jiàn)較多藍(lán)染鐵顆粒沉著；脾臟內(nèi)也可見(jiàn)到較多藍(lán)染鐵顆粒；肺組織內(nèi)見(jiàn)極少量藍(lán)染鐵顆粒；腎組織及心臟組織內(nèi)未見(jiàn)藍(lán)染鐵顆粒；
　　 3)Biotin-PEG-liposome SPIO組普魯士藍(lán)染色:肝臟組織及脾臟組織內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)染鐵顆粒,但較未包被裸SPIO組藍(lán)染鐵顆粒沉積少；肺組織、腎組織及心臟組織內(nèi)均未見(jiàn)藍(lán)染鐵顆粒。
　　 結(jié)論：
　　 我們合成的

37、Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒在體內(nèi)外均具有良好的逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的能力。
　　 第三章生物素-親和素系統(tǒng)預(yù)定位技術(shù)介導(dǎo)的新型主動(dòng)靶向性MR對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO納米微粒的荷人肺腺癌裸鼠MR成像實(shí)驗(yàn)
　　 研究目的：
　　 初步評(píng)價(jià)我們所制備的Biotin-PEG-liposome SPIO的腫瘤主動(dòng)靶向性,及“三步法”預(yù)定位技術(shù)與生物素-親和素級(jí)

38、聯(lián)放大系統(tǒng)的應(yīng)用效果。
　　 材料和方法：
　　 1皮下種植型荷人肺癌裸鼠模型的建立:
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞,胰酶消化,稀釋后用1ml注射器在24只裸鼠右側(cè)大腿根部皮下注射細(xì)胞懸液0.2ml(1×107個(gè)/ml),飼養(yǎng)并定期觀察,待腫瘤直徑達(dá)1～2cm,即可開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理:
　　 采用隨機(jī)數(shù)字法將上述24只荷人肺腺癌裸鼠隨機(jī)分成A、B、C三

39、組:A組:主動(dòng)靶向性對(duì)比劑(Biotin-PEG-liposome SPIO)+親和素+生物素化抗體組(n=4):尾靜脈注射單克隆抗體LM60950μg。24h后腹腔內(nèi)注射冷Av30μg,30min后注射SA10μg。48h后尾靜脈注射主動(dòng)靶向性對(duì)比劑(12.5μg Fe/0.2ml/mouse);
　　 B組:主動(dòng)靶向性對(duì)比劑(Biotin-PEG-liposome SPIO)+親和素+生理鹽水組(n=4):尾靜脈注射生理鹽水

40、(與上述LM609等體積)。24h后腹腔內(nèi)注射冷Av30μg,30min后注射SA10μg。48h后尾靜脈注射主動(dòng)靶向性對(duì)比劑(12.5μgFe/0.2 ml/mouse)；
　　 C組:被動(dòng)靶向性對(duì)比劑(非生物素化PEG-liposome SPIO)+親和素+生物素化抗體組(n=4):尾靜脈注射單克隆抗體LM60950μg。24h后腹腔內(nèi)注射冷Av30μg,30min后注射SA10μg。48h后尾靜脈注射被動(dòng)靶向性對(duì)比劑(12

41、.5μg Fe/0.2ml/mouse)。
　　 3 MRI掃描方法:
　　 采用肘關(guān)節(jié)線圈,掃描序列參數(shù)如下:FSE-T2WI(TR:4000ms,TE:85ms),FSE-T1WI(TR:425ms,TE:Min Full),FOV:10×10cm,層厚1.5mm,層距0mm。平掃結(jié)束后:于上述裸鼠尾靜脈注射主動(dòng)/被動(dòng)靶向性對(duì)比劑后1h、2h、4h、6h、8h、12h及24h分別行T2WI-MR增強(qiáng)掃描。
　　

42、 4 MR圖像觀察與測(cè)量:
　　 在T2WI上測(cè)量三組荷瘤裸鼠平掃及增強(qiáng)后各時(shí)間點(diǎn)腫瘤組織的信號(hào)強(qiáng)度(signal intensity,SI)及背景噪聲的標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation of the noise,SDn),計(jì)算出信噪比(Signal to noise ratio,SNR),公式為SNR=SI/SDn。繪制三組腫瘤的信噪比-時(shí)間動(dòng)態(tài)變化曲線,并計(jì)算三組荷瘤裸鼠平掃及強(qiáng)化峰值點(diǎn)腫瘤的信噪比下降百分比(

43、percentage of SNR loss,PSNRL)。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包,應(yīng)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)(Paired-Samples T Test)比較三組荷瘤裸鼠腫瘤平掃和增強(qiáng)后強(qiáng)化峰值點(diǎn)的SNR是否有顯著性差異；應(yīng)用協(xié)方差分析(analysis of covariance,ANCOVA)在扣除三組荷瘤裸鼠腫瘤平掃時(shí)SNR差異下比較強(qiáng)化峰值點(diǎn)的SNR是否有顯著性差異；應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)

44、計(jì)資料的方差分析(ONE-WAY ANOVA)比較三組荷瘤裸鼠腫瘤實(shí)質(zhì)增強(qiáng)后6h的PSNRL間是否有顯著性差異。若結(jié)果顯示有顯著性差異,再行SNK多重比較各組間PSNRL兩兩比較是否存在顯著差異。P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 6三組實(shí)驗(yàn)裸鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查:
　　 MR掃描結(jié)束后即行頸椎脫臼法處死裸鼠,并快速取其腫瘤組織,固定,包埋,并行HE及普魯士藍(lán)染色觀察。
　　 結(jié)果：
　　 1皮下種植型

45、荷人肺癌裸鼠模型的建立:
　　 24只荷瘤裸鼠全部存活,皮下種植人肺腺癌荷瘤裸鼠模型全部成功,瘤體直徑1～2cm。
　　 2三組荷瘤裸鼠皮下腫瘤組織T2WI上信噪比動(dòng)態(tài)變化情況。
　　 三組荷瘤裸鼠注射對(duì)比劑后,A組腫瘤組織在T2WI上信噪比開(kāi)始下降,于6小時(shí)左右達(dá)負(fù)性強(qiáng)化最高峰,隨后信號(hào)緩慢恢復(fù),至24小時(shí)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平掃時(shí)的信號(hào)水平；B組、C組腫瘤組織在T2WI上信噪比變化幅度低于A組,但負(fù)性強(qiáng)化高峰均位于靜注

46、對(duì)比劑后6小時(shí)處。
　　 3三組荷瘤裸鼠平掃及增強(qiáng)后6小時(shí)皮下移植型人肺腺癌組織的信噪比及信噪比降低百分比(PSNRL)比較:
　　 Paired-Samples T Test顯示三組荷瘤裸鼠皮下移植型人肺腺癌腫瘤組織平掃及增強(qiáng)后6h的信噪比(SNR)差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=651.701,P<0.001),說(shuō)明三組荷瘤裸鼠注射對(duì)比劑后6小時(shí)均可見(jiàn)明顯的腫瘤信號(hào)降低,即負(fù)性強(qiáng)化效果。
　　 ANCOVA結(jié)果顯

47、示在剔除平掃時(shí)腫瘤SNR差異的影響后,三組荷瘤裸鼠腫瘤組織增強(qiáng)后6h的SNR差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6675.979,P<0.001)；且結(jié)合調(diào)整后的均數(shù),說(shuō)明A組負(fù)性強(qiáng)化效果優(yōu)于B組,B組負(fù)性強(qiáng)化效果優(yōu)于C組?？梢?jiàn)只有尾靜脈注射主動(dòng)靶向性對(duì)比劑(Biotin-PEG-liposome SPIO)+親和素+生物素化抗體的A組荷瘤裸鼠腫瘤部位信號(hào)降低最為顯著(呈負(fù)性增強(qiáng)),而未注射生物素化抗體的B組及未注射靶向性對(duì)比劑的C組腫瘤增強(qiáng)前

48、后亦顯示信號(hào)減低,但強(qiáng)化效果均不如A組明顯。
　　 ONE-WAY ANOVA結(jié)果顯示三組荷瘤裸鼠腫瘤實(shí)質(zhì)增強(qiáng)后6h的PSNRL間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3055.533,P<0.001)。進(jìn)一步的SNK多重比較示各組PSNRL間兩兩差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),以A組降低最為顯著,B組其次,C組降低最不明顯。
　　 4三組荷瘤裸鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查結(jié)果:
　　 HE染色圖片顯示裸鼠皮下種植型人肺

49、腺癌腫瘤組織細(xì)胞較致密,核大而圓,且深染,呈藍(lán)色；細(xì)胞質(zhì)較少,呈淡紅色。
　　 普魯士藍(lán)染色圖片顯示三組裸鼠腫瘤組織內(nèi)清晰可見(jiàn)散在藍(lán)染顆粒,數(shù)量以A組最多,B組其次,C組較少。
　　 結(jié)論：
　　 基于BAS系統(tǒng)的三步法預(yù)定位技術(shù),應(yīng)用我們合成的新型靶向性MR對(duì)比劑——Biotin-PEG-liposome SPIO納米微?？沙醪綄?shí)現(xiàn)腫瘤組織的主動(dòng)靶向性MR顯像。
　　 本研究的不足及有待改進(jìn)之處：

50、>　　 1.由于脂質(zhì)體的包封率(encapsulation efficiency,EE)會(huì)直接影響對(duì)比劑的質(zhì)量,為此有必要考察包封率,并優(yōu)化制備過(guò)程,在不影響粒徑大小的前提下最大限度提高脂質(zhì)體的包封率。
　　 2.“三步法”預(yù)定位組內(nèi)腫瘤的強(qiáng)化主要在于抗原抗體的特異性反應(yīng)及BAS的特異性放大作用；而在實(shí)際應(yīng)用中,腫瘤抗原表達(dá)的多樣性和不一致性勢(shì)必對(duì)成像效果會(huì)有所影響。此外,多次注射的體內(nèi)過(guò)程復(fù)雜,抗體和對(duì)比劑也會(huì)因多次注射而造

51、成損耗。再者,在特定時(shí)間內(nèi)多次注射毫克級(jí)單位的蛋白,在人體內(nèi)應(yīng)用可能會(huì)造成一定程度的免疫反應(yīng)。
　　 3.盡管BAS具有放大作用,但與直接增強(qiáng)相比,“三步法”預(yù)定位技術(shù)的信號(hào)增強(qiáng)作用仍然是比較微弱的。要使腫瘤局部SPIO絕對(duì)數(shù)量進(jìn)一步增加,提高強(qiáng)化效果；可以通過(guò)加大應(yīng)用生物素化抗體和Av的量來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 4.單克隆抗體預(yù)定位效果,即其與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶點(diǎn)的結(jié)合率也是影響MR增強(qiáng)效果的重要因素,為此需要對(duì)其結(jié)合率進(jìn)行定