制備和鑒定腦靶向性脂質(zhì)體P-MMA-DOSPER.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的穿梭載體主要有病毒載體和非病毒載體兩類,由于兩者有著各自不同的缺點,還不能作為理想的基因載體運用于臨床。而載體的選擇是基因治療的關(guān)鍵,所以研究者們不遺余力的尋找安全、高效、穩(wěn)定的基因載體。相對于病毒載體脂質(zhì)體優(yōu)點在于安全、無免疫源性,缺點是基因轉(zhuǎn)移效率低。因此,脂質(zhì)體的研究主要集中于提高基因轉(zhuǎn)移效率方面。偶聯(lián)了抗體的免疫脂質(zhì)體就是通過抗體的靶向特異性實現(xiàn)脂質(zhì)體在某些組織器官的聚集來提高基因轉(zhuǎn)移效率。

2、 目的1.探求將脂質(zhì)體構(gòu)建成為更理想的腦內(nèi)基因轉(zhuǎn)移穿梭載體的方法。2.以神經(jīng)干細胞表面抗原為靶位,以衍生化單克隆抗體偶聯(lián)脂質(zhì)體腦內(nèi)尋靶,使基因治療更具目的性,提高基因轉(zhuǎn)移效率。 方法1.使用LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的JM-109大腸桿菌,以質(zhì)粒抽提試劑盒提取大量pEGFP-C2質(zhì)粒。經(jīng)過酶切電泳、DNA測序鑒定并以紫外分光光度法檢測質(zhì)粒濃度及純度后用于基因轉(zhuǎn)染。2.以二棕櫚酸磷

3、脂酰乙醇胺(DPPE)對單克隆抗體(anti-Lex/SSEA-1)進行衍生化,采用透析法分離純化衍生化抗體、紫外分光光度法檢測抗體衍生化的效率,間接熒光抗體實驗法檢驗衍生化后抗體的活性。實驗中用碳二亞胺法把衍生化的單克隆抗體P-MMA與陽離子脂質(zhì)體DOSPER共價偶聯(lián),制成有腦靶向性的脂質(zhì)體P-MMA-DOSPER。超速冷凍離心分離純化P-MMA-DOSPER,采用紫外分光光度法檢測抗體與脂質(zhì)體的偶聯(lián)率。3.P-MMA-DOSPER與

4、DOSPER分別包封綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C2),分兩組注入40只SD大鼠的側(cè)腦室內(nèi)進行隨機對照試驗。脂質(zhì)體通過腦室管膜到達腦實質(zhì)把質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入神經(jīng)干/祖細胞。第1、3、7、14天取腦冰凍切片,抗nestin抗體免疫熒光染色,熒光顯微鏡觀察基因表達情況。實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理,多組數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計的方差分析結(jié)合SNK檢驗;兩組間比較采用成組t檢驗。P<0.05為差別有顯著性統(tǒng)計學意義。 結(jié)果1.質(zhì)粒

5、抽提試劑盒提取質(zhì)粒約200μl,酶切電泳及DNA測序確定為pEGFP-C2質(zhì)粒,紫外分光光度法檢測pEGFP-C2質(zhì)粒濃度為1.596μg/μl,Dλ260/Dλ280=1.975純度完全符合基因轉(zhuǎn)染要求;2.衍生化的單克隆抗體P-MMA活力有所下降約為原單克隆抗體MMA活力的1/4,間接熒光抗體試驗(IFA)顯示P-MMA與抗原Lex/SSEA-1仍具有足夠的特異性結(jié)合能力,能夠識別并標記神經(jīng)干細胞;在偶聯(lián)促進劑碳二亞胺的作用下單克隆

6、抗體與陽離子脂質(zhì)體共價偶聯(lián)率可以高達73.7%。3.大鼠腦組織切片在熒光顯微鏡下可見注射一側(cè)側(cè)腦室周圍GFP表達,尤以側(cè)腦室角多見,偶見于對側(cè)側(cè)腦室、第三腦室。其中轉(zhuǎn)染后1天,GFP表達量較少、不穩(wěn)定且主要集中于室管膜下區(qū),轉(zhuǎn)染后3至7天GFP表達明顯增多、增強,轉(zhuǎn)染后14天仍可見GFP表達但有減弱趨勢。各時間點P-MMA-DOSPER組的GFP+/nestin+細胞在nestin+細胞中比率均高于DOSPER組,差別具有統(tǒng)計學意義(P

7、<0.01),兩組中轉(zhuǎn)染后1天的GFP+/nestin+細胞在nestin+細胞中比率低于3、7、14天,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而其余各時間點之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結(jié)論衍生化的單克隆抗體P-MMA活力有所下降,但仍與抗原Lex/SSEA-1具有足夠的特異性結(jié)合能力,能夠識別并標記神經(jīng)干細胞,并且衍生化的單克隆抗體與陽離子脂質(zhì)體能夠獲得較高的共價偶聯(lián)率;P-MMA-DOSPER能夠包封pEGFP-

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