長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體的合成及與SPIO在MRI淋巴成像的對比研究.pdf

1、研究目的：
　　 1.嘗試制備長循環(huán)SPIO(Superparamagnetic Iron Oxide)脂質(zhì)體,優(yōu)選出最佳制備方案,并對并對其粒徑大小、粒徑分布進(jìn)行表征；透射電鏡來測定其形態(tài)和大??；
　　 2.建立新西蘭大白兔反應(yīng)性增生及 VX2 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型,經(jīng)耳緣靜脈注射長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體,進(jìn)一步評估其淋巴組織靶向增強(qiáng)及長循環(huán)效果,并與傳統(tǒng) SPIO網(wǎng)狀內(nèi)皮陰性對比劑對比,評估兩者在 MR 淋巴成像中對良、惡性淋

2、巴結(jié)診斷和鑒別診斷的價值。
　　 材料和方法
　　 一、長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體的制備及表征
　　 (一)制備工藝的確定
　　 精密稱取一定量的Feso4與Fecl3堿性條件下反應(yīng)后用氨水洗滌,加入1g月桂酸攪拌無沉淀后加熱數(shù)分鐘,于500ml的TES緩沖液透析2天,每隔8小時換液。另取DSPG 和DSPE-PEG2000溶于氯仿,于恒溫磁力攪拌器內(nèi)攪拌至澄清后,置于三頸瓶中沖氮?dú)獯蹈陕确?成膜后加入20ml

3、 TES 緩沖液,超聲震蕩分散后,4℃條件下離心 10000 轉(zhuǎn)/分,10min,取上清,得到空白脂質(zhì)體?？瞻字|(zhì)體和吸附月桂酸的SPIO 混合后透析3天后,凝膠過柱后置于4℃冰箱備用。
　　 (二)空白脂質(zhì)體及長循環(huán)SPIO 脂質(zhì)體粒徑及其分布的測定用 Malvern-3000HS 激光粒度分析儀測定粒徑及其分布:吸取5ul制備的相應(yīng)樣品,用雙蒸水稀釋至量杯中。所選激光光源波長為 633.0nm,測試溫度為 25.00±0.0

4、5。
　　 (三)空白脂質(zhì)體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO及長循環(huán)SPIO 脂質(zhì)體的形態(tài)觀察用透射電鏡(日立 H-600)觀察空白脂質(zhì)體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO及長循環(huán)SPIO 脂質(zhì)體大體形態(tài)。具體操作方法為:1:4蒸餾水稀釋純凈空白脂質(zhì)體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO 及長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體液體,取 1 滴放在鍍膜銅網(wǎng)上,濾紙吸去多余液體,加入2％磷鎢酸染30s,干燥后電鏡下觀察。
　　 (四)長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體鐵含量的測定采用臨

5、二氮菲法測量長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體中鐵含量。
　　 (五)X射線衍射分析分別取真空干燥的月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒和長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米顆粒研細(xì),置于射線粉末(多晶)衍射儀中。將所得的圖譜與國際粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會出版的PDF卡片比較,以此來確定樣品所具備的晶體結(jié)構(gòu)。
　　 二、靜脈注射長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體及傳統(tǒng)SPIO在MR淋巴成像中對照研究
　　 (一)實(shí)驗(yàn)動物分組
　　 健康成年新西蘭白兔24只,

6、由空軍醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,體重2.0～2.5kg,采用隨機(jī)法分為 2 組:反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組(n=12)、VX2 腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組(n=12)。
　　 (二)動物模型建立
　　 單側(cè)肌肉注射0.5ml蛋黃乳膠于新西蘭白兔后腿,用于建立反應(yīng)性增生淋巴結(jié)模型。從 VX2 荷瘤種兔取生長活躍的腫瘤組織,研磨成混懸液,抽取 0.5ml(濃度大約107/ml)混懸液單側(cè)后腿肌肉接種于新西蘭大白兔,用于建立 VX2 肉瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

7、模型。
　　 (三)MRI掃描
　　 1、平掃:MRI 掃描采用頭部線圈,掃描序列及參數(shù)為:T1WI(TR/TE=539/14ms)橫斷位及矢狀位,T2WI(TR/TE=2234/85ms)橫斷位及矢狀位。
　　 2、增強(qiáng)掃描
　　 1、反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組:采用隨機(jī)法將反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組的新西蘭大白兔分成長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體增強(qiáng)Ⅰ組(n=6)和SPIO增強(qiáng)Ⅱ組(n=6)。在平掃完畢后,在平掃完畢后,在增強(qiáng)

8、增強(qiáng)Ⅰ組新西蘭白兔耳緣靜脈注射0.5ml的長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體,在增強(qiáng)Ⅱ組注射0.5ml 20umol Fe/ml的SPIO,掃描時間為給藥后 15 分鐘、30 分鐘、60分鐘、4小時,24小時、48小時進(jìn)行掃描,掃描參數(shù)同平掃。
　　 2.、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增生組:將腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組分為長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體增強(qiáng)Ⅰ組(n=6)和SPIO增強(qiáng)Ⅱ組(n=6)。對比劑注射劑量及方式同反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組,掃描時間為給藥后15分鐘、30分鐘

9、、60分鐘、4小時,24小時、48小時進(jìn)行掃描,掃描參數(shù)同平掃。
　　 (四)圖像評估
　　 1、測量淋巴結(jié)大小
　　 在 T1WI 像上,測量各組腘窩后淋巴結(jié)的短徑,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并與淋巴結(jié)病理解剖標(biāo)本的實(shí)測值作對照。
　　 2、在不同序列上分別測量平掃、增強(qiáng)后腘窩淋巴結(jié)的信號強(qiáng)度,測背景噪聲的標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation of the noise,SDN)。計算各組淋巴結(jié)的信噪比

10、(Signalto noise ratio.SNR)
　　 (五)病理組織學(xué)檢查
　　 所有實(shí)驗(yàn)動物在完成 MRI 增強(qiáng)掃描后,用靜脈過量麻醉法處死動物,仔細(xì)暴露腘窩淋巴結(jié),摘除并測量淋巴結(jié)的短徑,計算淋巴結(jié)數(shù)目。然后用 10～15％中性福爾馬林浸泡、固定,常規(guī)石蠟包埋,切片后行 H-E 染色觀察淋巴結(jié)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化,判別其良惡性。
　　 (六)統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用 SPSS13.0 軟件包,采用兩獨(dú)

11、立樣本 t 檢驗(yàn)評價平掃各組不同序列淋巴結(jié)的SNR、組間各序列圖像上長循環(huán) SPIO、SPIO 增強(qiáng)后淋巴結(jié) SNR 是否有顯著性差異。P<0.05 認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 一、空白脂質(zhì)體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO及長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體脂質(zhì)體的表征
　　 1.透射電鏡下空白脂質(zhì)體平均粒徑約20nm,月桂酸穩(wěn)定的SPIO 平均粒徑約12nm,長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體平均粒徑約為 60nm。
　　

12、 2.透射電鏡觀察空白脂質(zhì)體呈類圓形、空泡狀,大小分布較均勻,表面光滑,粒子間無粘連。月桂酸穩(wěn)定的SPIO 呈類圓形、形態(tài)規(guī)則、大小均勻的顆粒,可見少許團(tuán)聚現(xiàn)象。長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體呈類圓形,大小均勻,表面平滑完整,粒子之間無粘連,可見殼-核結(jié)構(gòu)。
　　 3.X 射線衍射分析:月桂酸穩(wěn)定的SPIO 納米微粒和長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體納米微粒的衍射圖說明產(chǎn)物均為面心立方尖晶石結(jié)構(gòu)的Fe3O4,而且粒子的結(jié)晶狀態(tài)很好。

13、　　 4.用 Malvern-3000HS 激光粒度分析儀測定的長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體測定數(shù)據(jù)為:強(qiáng)均粒徑 di=78.7nm；體均粒徑 dv=76.7nm；數(shù)均粒徑 dn=73.5nm,峰面積:100％,峰數(shù)為 1；多分散系數(shù)(Poly.index)為 0.212。
　　 5.鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.1947C+0.0008,R2=0.9982。測得長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體的鐵含量為 6.7213mg/ml。
　　

14、 二、模型的建立及病理表現(xiàn)
　　 1、反應(yīng)性增生淋巴結(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)均制作成功,在 T1WI 上的SNR 均無顯著性差異(t=-0.352,P=0.732)及 T2WI 圖像中 SNR 亦無顯著性差異(t=-0.924,P=0.377),平掃兩組腘窩淋巴結(jié)短徑無顯著性差異(t=-1.373,P=0.200),但腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)平均直徑大于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)。
　　 2、各組腘窩淋巴結(jié)平掃信號特點(diǎn)在 T1WI 像上,相

15、對于肌肉及脂肪,各組淋巴結(jié)均呈稍高信號,在 T2WI 像上,各組淋巴結(jié)均呈較高信號。
　　 3、靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體及 SPIO后各組淋巴結(jié)MRI 表現(xiàn)
　　 (一)反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組:耳緣靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體后,與平掃相比,腘窩淋巴結(jié)在 T2WI 像上信號可見較明顯降低,信號降低較均勻。耳緣靜脈注射SPIO 后,與平掃相比,腘窩淋巴結(jié)在 T2WI 信號降低不明顯。
　　 (二)腫瘤轉(zhuǎn)移性

16、淋巴結(jié)組:耳緣靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體后,與平掃相比,腘窩淋巴結(jié)在 T2WI 像上,腘窩淋巴結(jié)表現(xiàn)為陰性不均勻強(qiáng)化。耳緣靜脈注射 SPIO后,與平掃相比,腘窩淋巴結(jié)在 T2WI 信號降低不明顯。
　　 結(jié)論
　　 1、長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體的粒徑大小適宜,大體形態(tài)呈類圓形,可見殼-核結(jié)構(gòu)。
　　 2、靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質(zhì)體可用來進(jìn)行 MRI 淋巴造影。
　　 3、傳統(tǒng) SPIO 由于半