P-gp底物和抑制劑結(jié)合模式與作用機(jī)理.pdf

1、由ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白家族的多藥耐藥蛋白P-glycoprotein（P-gp）介導(dǎo)的藥物外排是引發(fā)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）的重要原因。抑制P-gp的藥物外排功能已成為當(dāng)前臨床克服MDR的重要策略之一。因此，P-gp底物和抑制劑的結(jié)合模式與作用機(jī)理研究對于探索腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制以及抗腫瘤藥物研發(fā)具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。迄今為止，由于缺乏人類P-gp蛋白

2、的三維結(jié)構(gòu)及實驗技術(shù)手段的制約，其底物結(jié)合模式與轉(zhuǎn)運機(jī)理仍然未知。論文采用定量構(gòu)效關(guān)系（Quantitative structure-activity relationship,QSAR）、分子對接（Molecular docking）和分子動力學(xué)（Molecular dynamics,MD）模擬等計算生物學(xué)理論與方法，對P-gp底物和抑制劑的分子識別、結(jié)合模式、結(jié)合通路以及作用機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并取得了階段性研究成果，主要包括：

3、r>　?、俨捎蔑@露化學(xué)模式（Emerging chemical patterns,ECP）以及聚合顯露模式分類算法（Classification by aggregating emerging patterns,CAEP）建立了P-gp底物分子識別模型。研究結(jié)果顯示：最優(yōu)ECP模型對803個訓(xùn)練集樣本、120個測試集樣本和179個獨立的外部驗證集樣本的預(yù)測準(zhǔn)確度分別達(dá)到了0.80、0.81和0.74。最優(yōu)模型僅涉及3個關(guān)鍵的分子結(jié)構(gòu)信息

4、，其預(yù)測準(zhǔn)確性和可解釋性均優(yōu)于已有模型。對P-gp底物18個ECP的聚類分析得到2組ECP集合（ECP group,ECPG），即ECPG1和ECPG2。結(jié)合部分底物的結(jié)合位點信息，發(fā)現(xiàn)具有ECPG1模式特征的底物傾向結(jié)合H位點，而具有ECPG2模式特征的底物傾向結(jié)合R位點。因此，論文所建ECP模型既可以識別底物分子，同時還可根據(jù)分子的ECP特征推測底物可能的結(jié)合位點。
　?、诓捎肊CP和CAEP分類算法建立了P-gp抑制劑分子識

5、別模型。從857個訓(xùn)練集樣本中選取7個抑制劑和27個非抑制劑樣本，并基于3個關(guān)鍵的分子結(jié)構(gòu)特征建立了最優(yōu)ECP模型。研究結(jié)果顯示：最優(yōu)模型對857個訓(xùn)練集樣本和418個測試集樣本的預(yù)測準(zhǔn)確度分別為0.80和0.86；對2個獨立的外部驗證集的預(yù)測準(zhǔn)確度則分別達(dá)到0.70和0.80。ECP特征分析發(fā)現(xiàn)：
　　1）HTv（H total index weighted by atomic van der Waals volume）是區(qū)分P

6、-gp抑制劑與非抑制劑的重要分子特征；
　　2）多數(shù)抑制劑分子傾向與底物的H位點發(fā)生結(jié)合。比較研究發(fā)現(xiàn)：P-gp底物和抑制劑在mLogP（Moriguchi octanol-water partition coefficient）、tPSA（Total polar accessible surface area）和nHacc（The number of H-bond acceptors）3個分子性質(zhì)的分布上具有顯著性差異，上述差異

7、可作為P-gp底物和抑制劑識別的重要特征。
　?、刍?個空載狀態(tài)下的小鼠P-gp晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:4M1M,4Q9H），采用Surflex-Dock方法對441個底物和666個抑制劑進(jìn)行了分子對接研究。結(jié)果顯示：底物和抑制劑在對接得分上無顯著性差異，表明對接得分無法區(qū)分底物與抑制劑。相比之下，抑制劑傾向與疏水性氨基酸殘基發(fā)生非特異性相互作用，而底物則更傾向與極性氨基酸殘基發(fā)生特異性靜電作用。與此同時，對于同一種受體構(gòu)象，P

8、-gp底物和抑制劑的結(jié)合位點基本相同。此外，利用已知結(jié)合位點的8個P-gp底物，論文對2種構(gòu)象下H和R位點的空間位置進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：對于2種P-gp受體構(gòu)象，H和R位點的位置有明顯差異。以上研究證實，由于空載狀態(tài)下P-gp構(gòu)象具較大柔性，P-gp可能包含多個H和R位點。
　?、軕?yīng)用PNEB（Partial nudged elastic band）模擬方法對P-gp底物和抑制劑的結(jié)合通路進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：位于磷脂雙分子層

9、的底物和抑制劑，可經(jīng)由TM4和 TM6形成的通道進(jìn)入 P-gp結(jié)合空腔。MM/GBSA結(jié)合自由能分析表明，底物Rhodamine-123和抑制劑QZ-Leu從磷脂雙分子層進(jìn)入結(jié)合空腔是一個自發(fā)過程。動力學(xué)軌跡分析結(jié)果顯示：對于大體積的抑制劑QZ-Leu，TM4的構(gòu)象發(fā)生了極為顯著的改變，表明TM4的結(jié)構(gòu)柔性對大體積分子的結(jié)合具有重要的調(diào)控作用。同時，在底物Rhodamine-123和抑制劑QZ-Leu的結(jié)合過程中，位于TM6的Phe33

10、9側(cè)鏈均發(fā)生了明顯的旋轉(zhuǎn)，暗示Phe339可能對分子結(jié)合通路的打開或關(guān)閉具有重要的門控作用。
　?、莶捎梅肿觿恿W(xué)模擬對P-gp底物和抑制劑的作用機(jī)理進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示：當(dāng)結(jié)合底物Rhodamine-123時，位于2個ATP結(jié)合位點的保守氨基酸殘基（Lys和Ser）間的距離相對減小，暗示底物的結(jié)合可促使NBD1和NBD2相互靠近，有利于NBD的二聚化和ATP水解位點的形成。而抑制劑QZ-Leu的結(jié)合則導(dǎo)致NBD1和NBD2間

11、的距離顯著增大，ATP結(jié)合位點更加開放。結(jié)果表明：底物和抑制劑的結(jié)合對NBDs的構(gòu)象具有重要影響。MM/GBSA結(jié)合自由能計算結(jié)果表明，抑制劑QZ-Leu與P-gp的親和活性較底物Rhodamine-123更高，據(jù)此推測抑制劑的高親和活性對維持P-gp的NBDs的開放構(gòu)象和抑制ATP水解活性有利；而底物相對的低親和活性則可能有利于后續(xù)的跨膜轉(zhuǎn)運過程。
　　總的來說，論文的研究結(jié)果可為P-gp底物和抑制劑的虛擬篩選、相關(guān)抗腫瘤藥物研