Bcl-2家族抑制劑ApoG2和NAD(P)H過氧化物酶抑制劑DPI抗鼻咽癌作用及分子機理.pdf

1、鼻咽癌是中國南部地區(qū)高發(fā)的一種來源于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤。目前，放射治療聯(lián)合以順鉑為基礎(chǔ)的化學治療是局部進展期鼻咽癌治療的主要方法。然而，近期的研究報道發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中高表達的多種癌基因，如抗凋亡的Bcl—2家族成員、c—Myc和LMP1等，導致鼻咽癌治療的長期療效欠佳。因此，本研究嘗試利用新的分子靶點藥物來抑制鼻咽癌細胞，并深入探討其抑癌機制。 Apogossypolone(ApoG2)是經(jīng)過改造的棉酚衍生物，它是一種新型

2、的抗凋亡Bcl—2家族蛋白的小分子抑制劑。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ApoG2能結(jié)合抗凋亡的Bcl—2家族蛋白，有效地抑制其抗凋亡的功能。在四種鼻咽癌細胞系C666-1、CNE-1、CNE—2和HONE-1中，ApoG2能選擇性的抑制C666-1、CNE-1和CNE—2細胞的增殖，誘導細胞色素c從線粒體釋放到細胞漿，促進凋亡相關(guān)蛋白caspase—3和caspase—9的活化，最終誘導鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡。然而ApoG2對HONE-1細胞卻沒有

3、明顯的抑制作用，其原因是在HONE-1細胞中，抗凋亡的Bcl—2家族蛋白的表達水平相對較低；然而，在三種敏感的鼻咽癌細胞系C666-1、CNE-1和CNE—2內(nèi)，抗凋亡的Bcl—2家族蛋白Bcl—2、Mcl-1和Bcl—xL的表達水平很高。此外，ApoG2通過靶向作用于抗凋亡Bcl—2家族蛋白，可抑制這類蛋白對線粒體外膜的保護作用，促進線粒體膜上的電壓依賴性的離子通道(VDAC)大量開放和腺苷轉(zhuǎn)位因子(ANT)的活化。因此，ApoG2處

4、理細胞半小時，即能誘導細胞線粒體膜電位顯著下降，而且導致一部分線粒體的外膜迅速瓦解。 此外，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)ApoG2處理的鼻咽癌細胞，在處理24小時后即被大量阻滯在細胞周期的S期。觀察ApoG2的結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)它含有多個具有強氧化性的芳香族碳氫化合物的醌基團。ApoG2在鼻咽癌細胞能誘導產(chǎn)生大量的ROS，在鼻咽癌細胞死亡中起著一定促進的作用，同時可能損傷細胞DNA，對細胞周期產(chǎn)生一定的影響。而且，Western Blot結(jié)果顯示，A

5、poG2能顯著抑制c—Myc蛋白和其下游分子Cyclin D1和Cyclin E的表達，并誘導P21表達上調(diào)。同時，siRNA干擾實驗證實了c—Myc信號通路對細胞周期的影響。所以，我們認為ApoG2對c—Myc信號通路的抑制導致大量的鼻咽癌細胞被阻滯在細胞周期的DNA合成期(S期)。 ApoG2不但單藥能有效的抑制腫瘤細胞，而且與順鉑(CDDP)有顯著的協(xié)同抑制腫瘤細胞的作用。在裸鼠移植瘤模型中，ApoG2單藥口服能抑制鼻咽

6、癌細胞移植腫瘤的生長；ApoG2聯(lián)合CDDP對腫瘤生長的抑制作用顯著強于單獨使用ApoG2或單獨使用CDDP對腫瘤的抑制作用。 多種抗腫瘤的化學藥物，如環(huán)蒽類抗生素、烷化劑、替尼伯甙和喜樹堿等，都能誘導腫瘤細胞產(chǎn)生大量的活性氧成分(reactive oxygen species，ROS)。細胞內(nèi)過量的ROS堆積在化學藥物誘導腫瘤細胞死亡中起著一定的作用。然而，研究也發(fā)現(xiàn)，適量增加的ROS會刺激細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，促進細胞增殖和惡性

7、轉(zhuǎn)化，最終導致腫瘤的形成。因此，在腫瘤形成早期，通過抑制細胞內(nèi)ROS水平的適度升高，可起到抑制腫瘤形成的作用。 Dibenziodolium(DPI)是NAD(P)H過氧化物酶家族(NOX)的抑制劑，能顯著抑制NP69-LMPI細胞內(nèi)ROS的水平，并且抑制NP69-LMPI細胞和鼻咽癌細胞SUNE-1的集落形成能力，誘導SUNE-1細胞和LMP1轉(zhuǎn)化的鼻咽上皮細胞NP69發(fā)生凋亡。近期的文獻報道發(fā)現(xiàn)NAD(P)H過氧化物酶(N

8、OX)是細胞內(nèi)一個非常重要的ROS產(chǎn)生系統(tǒng)，并在腫瘤形成中起著很重要的促進作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LMP1能通過JNK通路轉(zhuǎn)錄激活NOX家族調(diào)節(jié)亞基p22Phox，誘導鼻咽上皮細胞ROS的水平升高8到10倍(包括過氧化氫和一氧化氮)。此外，LMP-1通過活化PI3K/Akt通路，激活糖酵解無氧代謝途徑。由于NOX和糖酵解無氧代謝途徑中關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶(LDH)同樣以NAD(P)H為底物，所以NOX的活化可直接減少LDH的底物，進而減少

9、在高能量代謝下乳酸的產(chǎn)生和酸中毒的發(fā)生。因此，當我們使用DPI抑制NOX的活性后，不僅ROS的升高被抑制，而且細胞可產(chǎn)生大量的乳酸，最終抑制細胞的增殖。以上的結(jié)果都提示我們，在NP69-LMP1細胞中表達上調(diào)的NOX亞基p22phox不僅促進鼻咽上皮細胞ROS水平升高，而且?guī)椭鷲盒赞D(zhuǎn)化細胞維持高水平的糖酵解能量代謝。NOX抑制劑DPI和葡萄糖攝取抑制劑3-BrOP都能有效的殺傷LMP1轉(zhuǎn)化的NP69細胞，可開發(fā)為鼻咽癌預(yù)防和治療的藥物。

10、 總結(jié)ApoG2和DPI兩種藥物對鼻咽癌治療和預(yù)防中的作用，我們發(fā)現(xiàn)ApoG2不僅可以通過抑制抗凋亡的Bcl—2家族蛋白改變線粒體外膜的結(jié)構(gòu)和膜電位，誘導細胞凋亡，而且能通過抑制c—Myc信號通路阻滯細胞周期抑制細胞生長；此外，由于ApoG2化學結(jié)構(gòu)上有兩個具有強氧化性的芳香碳氫化合物的醌基團，因此它可以誘導細胞產(chǎn)生大量的氧自由基ROS，對細胞造成損傷。此外，通過研究相關(guān)癌基因LMP1改變鼻咽上皮細胞生化代謝在鼻咽癌發(fā)生過程中的