金黃色葡萄球菌非編碼RNA-L8以及TRAP蛋白生物學(xué)功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的人類致病菌，它能夠引起廣泛地感染，包括從皮膚炎癥、中毒性休克、肺炎到威脅生命的骨髓炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等一系列疾病。其通過表達各種表面粘附蛋白、分泌蛋白和毒力因子如蛋白A、蛋白酶、溶血素、腸毒素等引發(fā)各種疾病。目前臨床上治療金黃色葡萄球菌感染主要是采用聯(lián)合使用抗生素的方法，但耐藥性金黃色葡萄球菌株的出現(xiàn)致使許多抗生素變的無能為力。
　　 非編碼RNA，指的是

2、不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA，如tRNA，rRNA，miRNA，snRNA，sRNA等。它們廣泛存在于真核和原核細胞中，操縱著細胞許多生理功能。過去對于sRNA(small non-coding RNA)的研究主要集中在真核生物，發(fā)現(xiàn)了許多具有功能的sRNA分子如miRNA，它可以與靶基因互補調(diào)節(jié)特定基因的表達。近年來，隨著對原核生物研究的深入，發(fā)現(xiàn)在細菌體內(nèi)也存在著類似的非編碼sRNA，這些sRNA是一類長度一般在20至500個核苷酸左右

3、，執(zhí)行多種功能的非編碼RNA分子。不同的sRNA具有不同的功能，不同的sRNA發(fā)揮功能的機制也不相同。50％—60%的sRNA是通過與靶mRNA的配對來發(fā)揮其調(diào)控功能。它們通過配對影響翻譯的水平或影響rnRNA的穩(wěn)定性從而在轉(zhuǎn)錄水平對基因表達進行調(diào)控。有研究報道表明，細菌中的許多sRNA與其生長代謝和毒力調(diào)控過程密切相關(guān)。原核生物中sRNA的研究目前主要集中于大腸桿菌(Escherichiacoli)，已發(fā)現(xiàn)近百種sRNA。新近的研究結(jié)

4、果表明在革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌也存在新的sRNA，其中部分位于金黃色葡萄球菌基因組的病原島或只存在于致病菌株中，提示這些sRNA可能參與了致病菌毒素的表達調(diào)控。金黃色葡萄球菌RNAIII(一種sRNA)已經(jīng)被證實作用于多個毒力相關(guān)基因，參與調(diào)控金黃色葡萄球菌的致病性。
　　 Hfq（a host factor for RNA phage Qβ）蛋白最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，具有RNA伴侶分子活性，其主要的生物學(xué)功能是通過形成六聚

5、體與RNA結(jié)合來影響RNA的穩(wěn)定性或者是通過輔助sRNA與mRNA結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因的表達，它對于sRNA通過配對發(fā)揮功能至關(guān)重要。在研究基因表達調(diào)控時發(fā)現(xiàn)一些在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達的sRNA分子通常需要Hfq蛋白的輔助。這表明這些sRNA分子可能是一個sRNA家族，這個家族的重要特征是能有效地與Hfq蛋白結(jié)合并利用堿基配對與靶mRNA分子相互作用，從而調(diào)節(jié)了靶mRNA的表達。目前在大腸桿菌中，超過30%的非編碼sRNA能夠與Hfq蛋

6、白結(jié)合。
　　 本研究的第一部分為金黃色葡萄球菌中新的sRNA--L8生物學(xué)功能的研究。我們結(jié)合生物信息學(xué)的預(yù)測，進一步利用RACE的方法獲得一條新的全長sRNA，將其命名為L8。進一步構(gòu)建L8缺失突變菌株，通過一系列表型和應(yīng)激反應(yīng)實驗以及靶基因的尋找和鑒定，闡明了L8在金黃色葡萄球菌中的重要生物學(xué)功能。本部分的主要研究內(nèi)容如下：
　　 1．L8的發(fā)現(xiàn)、鑒定及相關(guān)檢測。結(jié)合生物信息學(xué)，我們在金黃色葡萄球菌中預(yù)測到一些新的

7、sRNA分子，并通過RACE的方法找到一條新的全長sRNA，命名為L8，進一步通過Northern Blot的方法驗證了其在金黃色葡萄球菌中的存在。提取重金屬離子和高滲應(yīng)激條件下的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行熒光定量PCR檢測L8的表達狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L8的表達水平下降。L8可以與RNA伴侶分子Hfq蛋白特異性結(jié)合，并在hfq突變菌株中表達水平下降。L8在RNaselII突變菌株中表達水平上升，在RNaseHII和RNaseZ突變菌株

8、中表達水平下降。
　　 2．金黃色葡萄球菌L8突變株制備及相關(guān)檢測。利用基因同源重組的原理制備L8的缺失突變菌株，一系列表型和應(yīng)激反應(yīng)實驗結(jié)果顯示L8缺失后，菌株在生長、生物膜的形成、自溶、全血中存活、中性粒細胞中存活以及H202中的存活均發(fā)生明顯變化，并且突變株對動物的致病性也明顯降低，表明sRNA-L8在金黃色葡萄球菌中有重要的生物學(xué)功能。
　　 3．L8靶基因的尋找和鑒定。通過生物信息學(xué)預(yù)測的L8靶基因為arlR，

9、首先利用熒光定量PCR檢測其在突變株中的表達狀況，發(fā)現(xiàn)在L8突變株中，arlR的表達水平明顯降低，提示L8可以正調(diào)控arlR的表達。Hfq蛋白能夠輔助L8和arlR的相互作用。然后我們又通過構(gòu)建LacZ報告載體進一步確定了arlR是L8的靶基因。
　　 總之，本部分研究結(jié)果表明我們新發(fā)現(xiàn)的sRNA-L8能夠正調(diào)控arlR的表達，從而影響金黃色葡萄球菌的致病性。
　　 早期的研究結(jié)果認(rèn)為TRAP是金黃色葡萄球菌內(nèi)與其致病性

10、相關(guān)的蛋白分子，其通過調(diào)控agr系統(tǒng)來影響金黃色葡萄球菌的致病性。但是后期的研究結(jié)果顯示TRAP蛋白與agr系統(tǒng)無關(guān)，其是否影響金黃色葡萄球菌的致病性還存在爭議。我們已有的結(jié)果和已發(fā)表的研究工作都表明TRAP蛋白的抗體能夠抑制金黃色葡萄球菌對機體的感染。
　　 本研究的第二部分為TRAP蛋白的生物學(xué)功能研究。我們通過構(gòu)建突變菌株并對其表型和應(yīng)激反應(yīng)進行檢測，鑒定其與agr系統(tǒng)的相關(guān)性，研究TRAP蛋白在金黃色葡萄球菌中的生物學(xué)功

11、能。本部分的主要研究內(nèi)容如下：
　　 1．金黃色葡萄球菌traP突變株制備及相關(guān)檢測。利用基因同源重組的原理制備traP的缺失突變菌株，突變株中agr系統(tǒng)沒有發(fā)生突變，agr系統(tǒng)表達水平?jīng)]有明顯改變，這表明TRAP蛋白的確與agr系統(tǒng)無關(guān)。但是我們發(fā)現(xiàn)突變株對動物的致病性明顯降低，一系列表型和應(yīng)激反應(yīng)實驗結(jié)果也顯示traP缺失后，菌株在生長、表面電荷、疏水性、中性粒細胞中存活以及H202中的存活均發(fā)生明顯變化，證明TRAP蛋白在

12、金黃色葡萄球菌中有重要的生物學(xué)功能。
　　 2．TRAP蛋白影響中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬。中性粒細胞吞噬實驗顯示traP缺失菌株更容易被吞噬，但重組表達的TRAP蛋白不能夠影響中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬。我們進一步通過分析突變菌株和野生型菌株細胞壁蛋白的表達譜，發(fā)現(xiàn)了一個明顯升高的蛋白條帶，質(zhì)譜分析表明該蛋白為功能未知的蛋白，我們將其命名為SAP。實時定量PCR結(jié)果表明編碼該蛋白的基因在突變株中的表達水平明顯升高。