抗壞血酸-PCL生物材料修復(fù)新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤、外科手術(shù)和各種先天性骨骼畸形導(dǎo)致的軟骨缺損修復(fù)問題一直以來是困擾臨床醫(yī)師的難題。關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床常見疾病，由于軟骨組織內(nèi)沒有血管供應(yīng)、神經(jīng)支配和淋巴回流，加之細胞成分單一，其自身修復(fù)能力非常有限。在軟骨發(fā)生缺損后，病人出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛以及運動障礙，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎，造成惡性循環(huán)，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。近年來，對軟骨缺損修復(fù)方法的研究有了飛躍的發(fā)展。軟骨修復(fù)材料的日漸豐富，以“生物治療”為理念的新型修復(fù)方法，為軟骨

2、缺損修復(fù)提供了眾多理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。生物材料、種子細胞、生物活性的因子的不同組合在軟骨缺損的修復(fù)中展現(xiàn)了不同的修復(fù)能力，尚存在爭議。因此，不斷加深對軟骨生物材料的實驗研究，從而構(gòu)建新型的軟骨修復(fù)生物材料，觀察其在生物體內(nèi)的軟骨修復(fù)效果，是當前骨科學(xué)研究是重點。不僅可以加深軟骨組織工程的研究深度，實踐新技術(shù)，也可為臨床軟骨缺損的治療提供治療新思路和新方法。
　　研究目的：
　　本研究所使用的原代軟骨細胞來源于新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)

3、，無菌分離后進行體外培養(yǎng)擴增，并用復(fù)合不同濃度的抗壞血酸培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)，觀察與評估抗壞血酸對新西蘭白兔軟骨細胞的增值和成軟骨分化的影響。此外，PCL生物材料搭載AA活性因子構(gòu)建生物功能化復(fù)合材料修復(fù)新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)單純軟骨缺損，觀察聚已內(nèi)酯/抗壞血酸復(fù)合材料在軟骨缺損再生修復(fù)應(yīng)用的效果，為軟骨組織工程的基礎(chǔ)研究提供實驗資料和科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.抗壞血酸在新西蘭白兔軟骨細胞中的促增殖和成軟骨分化效果分析

4、r>　　動物使用6周齡新西蘭白兔，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞猝死，無菌分離膝關(guān)節(jié)上皮組織，暴露膝關(guān)節(jié)，無菌刀片削取關(guān)節(jié)軟骨，用二步酶消化法分離獲取原代軟骨細胞，與25cm2培養(yǎng)瓶中分別培養(yǎng)1、4、7、14天，每瓶種植細胞數(shù)為2.5*105個實驗組采用復(fù)合抗壞血酸培養(yǎng)液培養(yǎng)(濃度為20ug/mL、50ug/mL100ug/mL)，對照組則采用普通培養(yǎng)基，即不添加抗壞血酸，其余相同。甲苯胺藍法檢測細胞外基質(zhì)進行細胞鑒定。根據(jù)實驗計劃不同時間段觀察細

5、胞形態(tài)、生長密度。羥脯氨酸試劑盒消化法檢測細胞分泌的羥脯氨酸含量檢測。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)測定其聚集蛋白聚糖(Aggrecan)，一型膠原(COL1)，二型骨膠原(COL2)等軟骨相關(guān)基因的表達結(jié)果。分析不同組的成軟骨分化效果。
　　2.PCL/抗壞血酸復(fù)合材料用于修復(fù)新西蘭白兔單純軟骨缺損的實驗研究
　　材料使用復(fù)合了抗壞血酸(Ascobic Acid,AA)的聚已內(nèi)酯(polycaprolactone

6、，PCL)材料，每組材料搭載相同的抗壞血酸濃度，另設(shè)置單純材料組、空白組各一組，共3組。A組：PCL+AA;B組：單純PCL材料;C組：單純手術(shù)空白對照，其中A、B兩組填充材料后加入制備好的纖維蛋白膠(fibrin gel10μg)和凝血酶原(thrombinogen10μg)混合物以固定材料。將8只雄性6月齡新西蘭白兔完全隨機分成3組，每只動物于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨臏股關(guān)節(jié)面制備直徑3.5mm、深3mm的單純軟骨缺損模型，不鉆通骨髓腔。于術(shù)

7、后6周和12周，取材，進行大體觀察、HE染色、番紅固綠染色、Wakitani修復(fù)效果評分以及相關(guān)定量分析。
　　研究結(jié)果：
　　在倒置相差顯微鏡下觀察，體外原代培養(yǎng)新西蘭白兔軟骨細胞生長旺盛，細胞體積較小，呈多角形，4d培養(yǎng)后，呈梭形并有少量突起，細胞核較大，細胞排列緊密，14d后呈典型“鋪石路”樣形態(tài)。根據(jù)取材部位、細胞形態(tài)、甲苯胺藍染色陽性，證明細胞分泌軟骨和合成蛋白聚糖，可以間接鑒定培養(yǎng)細胞為軟骨細胞。在1/4/7/1

8、4天各時間點對AA組和對照組細胞分泌的HYP進行測定，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，AA組HYP分泌量明顯大于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中AA50組在各時間點分泌量都大于其他各組。RT-PCR結(jié)果提示各檢測基因在不同時間點達到峰值，成骨基因Col1在培養(yǎng)初期表達較高，隨后減弱，并且AA組各個時間點的表達都低于單純培養(yǎng)液組。成軟骨分化基因Col2在7d時表達峰值，都高于對照組，其中AA50組中與單純培養(yǎng)液組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)A

9、ggrecan4d時達峰值，隨后一直保持較高表達量，AA組表達均高于單純培養(yǎng)液組。
　　動物手術(shù)過程無動物出現(xiàn)麻醉死亡，術(shù)后無動物出現(xiàn)感染。對取材組織分析顯示：6周標本外觀上PCL+AA組修復(fù)效果明顯優(yōu)于單純材料組，空白組組未見軟骨缺損修復(fù)，邊界清楚，中央凹陷明顯。PCL+AA組缺損被白色半透明堅硬組織修復(fù)，富有光澤。Wakitani評分PCL+AA組優(yōu)于單純材料、空白缺損兩組(P＜0.05)。12周PCL+AA組番紅固綠染色顯示

10、軟骨修復(fù)情況優(yōu)于6周PCL+AA組標本。HE染色各組均未見急慢性炎癥細胞浸潤。新生軟骨面積百分數(shù)和新生軟骨細胞數(shù)定量分析提示PCL+AA組均明顯大于單純PCL材料組(P＜0.05)，C組未見明顯軟骨長出。12周PCL+AA組標本評分結(jié)果與6周無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)
　　研究結(jié)論：
　　抗壞血酸因子對軟骨細胞分泌HYP（膠原合成）有促進作用，并且能促進軟骨細胞成軟骨分化。復(fù)合AA的PCL生物材料具有良好的生物相容性，軟骨