PLGA-PCL-PLGA-HA-βTCP雙相支架結(jié)合BMSCs修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)分化的方法，研究其體外增殖，分化能力。
　　 方法：取兔骨髓沖洗液，采用密度梯度離心與全骨髓培養(yǎng)結(jié)合的方法分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)；流式細(xì)胞儀鑒定第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面CD29、CD34和CD44抗原；使用MTT法測定第4、8代細(xì)胞的增殖情況，繪制生長曲線；分別體外誘導(dǎo)第3代細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分化，對誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色、VonKossa染

2、色、I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Ⅰ型膠原RT-PCR檢測鑒定，對誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Ⅱ型膠原RT-PCR檢測鑒定。
　　 結(jié)果：經(jīng)密度梯度離心結(jié)合全骨髓培養(yǎng)法分離所得到的細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形或紡錘形，接近融合狀態(tài)時可呈現(xiàn)旋渦樣生長。所分離的細(xì)胞表達(dá)CD44、CD29，不表達(dá)CD34。生長曲線顯示第4、8代細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖能力；向骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)陽性，

3、VonKossa染色可見鈣結(jié)節(jié)，I型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈現(xiàn)陽性，RT-PCR出現(xiàn)I型膠原條帶：向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色被染成紫紅色，呈現(xiàn)出異染性，番紅O染色見細(xì)胞聚集部位呈紅色，表明細(xì)胞合成和分泌糖胺多糖，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性，RT-PCR可見Ⅱ型膠原條帶。
　　 結(jié)論：密度梯度分離法與全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合能理想的分離、純化BMSCs：BMSCs在誘導(dǎo)劑作用下能表現(xiàn)出成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性，能用于組織

4、工程中修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨損傷；BMSCs在體外具有良好的增殖、自我更新和定向分化潛能，是組織工程理想的種子細(xì)胞。
　　 目的：研究制備出一種新型雙相PLGA支架，并進(jìn)行各項(xiàng)結(jié)構(gòu)性能和生物學(xué)特性檢測，探討其作為組織工程支架的可行性。
　　 方法：支架制備：采用粒子瀝濾致孔法結(jié)合澆注成型法制備雙相PLGA支架，再對整個支架表面進(jìn)行透明質(zhì)酸真空吸附；結(jié)構(gòu)觀察：觀察支架大體外觀，并將制備好的支架切面進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察；生

5、物相容性檢測：將支架植入活體兔皮下組織內(nèi)，觀察機(jī)體對支架的反應(yīng)及支架的降解情況：分別對植入細(xì)胞的支架進(jìn)行掃描電子顯微鏡和石蠟切片HE染色觀察。
　　 結(jié)果：制備好的支架為白色海綿樣物質(zhì)，肉眼可見分為上下兩層。掃描電子顯微鏡觀察兩層的孔徑大小符合設(shè)計(jì)要求；植入活體內(nèi)的支架沒有引起異物炎癥反應(yīng)，并逐步降解，12周時已基本降解完全：掃描電子顯微鏡和石蠟切片HE染色均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與支架結(jié)合良好。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備出的雙相PL

6、GA支架制備方法簡單，各項(xiàng)性能參數(shù)易于控制，且兩層支架之間結(jié)合緊密，改進(jìn)了雙層支架容易開裂的缺陷；支架與BMSCs的生物相容性良好，有利于BMSCs吸附、增殖；對支架兩層進(jìn)行相應(yīng)的改性后，能更好的促進(jìn)BMSCs分化為目的細(xì)胞；雙相PLGA支架與關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的正常生理結(jié)構(gòu)更加接近，且降解時間理想，能更好的修復(fù)軟骨和軟骨下骨損傷。
　　 目的：研究雙相PLGA支架結(jié)合BMSCs修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的效果，探討雙相PLGA支架

7、做為組織工程支架承載BMSCs修復(fù)骨軟骨缺損的可行性。
　　 方法：將30只健康新西蘭大白兔，60個膝關(guān)節(jié)股骨滑車部位造成直徑5mm，深4～5mm的骨軟骨缺損，并隨機(jī)分為三組(A組、B組、C組)，A組為自發(fā)修復(fù)，不植入任何材料，B組僅植入雙相支架修復(fù)，C組植入支架與BMSCs的復(fù)合物。術(shù)后6周、12周分批隨機(jī)處死，取標(biāo)本進(jìn)行大體形態(tài)觀察和組織學(xué)觀察其修復(fù)效果并評分比較；對B組、C組和正常關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)測試，并將各項(xiàng)參數(shù)與正

8、常關(guān)節(jié)組織比較。
　　 結(jié)果：術(shù)后6周，A組大體觀察評分4.3±0.9，組織學(xué)評分0.8±0.2；B組大體觀察評分6.8±0.7，組織學(xué)評分5.1±0.8：C組大體觀察評分8.1士0.4，組織學(xué)評分12.4±0.9。術(shù)后12周，A組大體觀察評分5.2士1.2，組織學(xué)評分3.7±0.5：B組大體觀察評分7.7±0.8，組織學(xué)評分10.3士0.6；C組大體觀察評分9.2±0.3，組織學(xué)評分17.2±0.3?？偟男迯?fù)效果C組最理想，A

9、組最差。生物力學(xué)測試得出：正常關(guān)節(jié)蠕變時間2763±649s，應(yīng)力松弛時間2142±4402s，楊氏模量0.36±0.22MPa：B組標(biāo)本蠕變時間2189±533s，應(yīng)力松弛時間1647±38ls，楊氏模量0.29±0.17MPa；C組標(biāo)本蠕變時間2314±592s，應(yīng)力松弛時間1936±334s，楊氏模量0.32±0.13MPa。B組和C組標(biāo)本的蠕變時間和應(yīng)力松弛時候較正常關(guān)節(jié)均縮短，楊氏模量較正常關(guān)節(jié)偏小，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。