食品企業(yè)污水中細(xì)菌的基因芯片快速檢測技術(shù).pdf

1、食品企業(yè)污水中含有各種無機(jī)污物和有機(jī)污物，同時還含有很多細(xì)菌，包括大腸桿菌、可能存在的致病細(xì)菌和雜菌等，因此水質(zhì)混濁而臟臭。同時，由于污水處理效率低(估計僅為20％～30％)，大部分污水未經(jīng)妥善處理就直接或間接排入水體，惡化水質(zhì)，污染環(huán)境，其中夾帶的致病菌，將導(dǎo)致多種疾病的爆發(fā)和流行，嚴(yán)重威脅著人類的健康。 為了快速、準(zhǔn)確地檢測食品企業(yè)污水中存在的細(xì)菌，建立一種采用基因芯片技術(shù)對食品企業(yè)污水中常見細(xì)菌檢測和鑒定的實驗方法。

2、 從上海部分食品企業(yè)采集污水水樣后進(jìn)行純種分離培養(yǎng)，從第一期水樣中獲得38株純種菌種樣本；第二期水樣培養(yǎng)后，又分離出20株純種菌種樣本。對兩期培養(yǎng)所得菌種進(jìn)行鑒定，共得12株純種細(xì)菌。此次實驗中的絕大多數(shù)細(xì)菌都為革蘭氏陰性桿菌，且絕大多數(shù)菌種為好氧型菌，其余為兼性菌，并不存在厭氧性菌。 實驗中設(shè)計了8對特異引物并將8對引物分成兩組進(jìn)行PCR反應(yīng)：引物Ⅰ為(Kp+HlyA+InvA+ipaH)；引物Ⅱ為(Cadc+OprI+En

3、t+23SrRNA)效果良好。 通過實驗摸索，適宜的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35個循環(huán)，確定適宜雜交溫度為48℃，洗片采用洗液A和洗液B。 本實驗所涉及的7種細(xì)菌中，O157:H7型大腸桿菌和沙門氏菌的檢測濃度可以低至10-3μg/ml，在整個擴(kuò)增體系中達(dá)到pg級；即使是敏感性相對較低的肺克菌、綠膿桿菌、腸球菌和志賀氏菌，其檢測下限也為10-1μg/ml。實驗中所制作的基因芯片對目的細(xì)菌檢測的敏感性是很高的。 隨機(jī)選擇

4、肺炎克雷白(Kp)、大腸桿菌(Cadc)和沙門氏菌(InvA)為代表進(jìn)行芯片重復(fù)性檢測實驗，根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果和芯片雜交掃描結(jié)果驗證芯片檢測的重復(fù)性。檢測結(jié)果表明，用實驗中制備的基因芯片檢測上述3種細(xì)菌具有良好的重現(xiàn)性。 用實驗制備的基因芯片對模擬水樣檢測的結(jié)果與疾控中心配制的菌液相比較，準(zhǔn)確率100％，說明該基因芯片對目的細(xì)菌特征基因的檢測結(jié)果是可靠的，并用該方法對從實際水樣中分離的細(xì)菌進(jìn)行了檢測，具有高準(zhǔn)確率。該項技術(shù)的