血液病原聯(lián)合檢測基因芯片技術(shù)的研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩70頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、為保證臨床用血安全,血液在經(jīng)采集進入血庫前要經(jīng)過嚴格檢測。人類獲得性免疫缺陷綜合癥、乙型肝炎、丙型肝炎以及梅毒作為血液篩查的常規(guī)項目,通常要經(jīng)過嚴格的初篩和復篩,使用兩種不同廠家的試劑由不同的檢測人員進行兩次檢測,且兩次結(jié)果均為陰性的血液標本方可入庫。引起這四種疾病的病原體HIV、HBV、HCV以及梅毒螺旋體若進入血液對人體健康危害極大,成為嚴重威脅輸血安全的潛在因素,因此如何有效控制和預防血源性傳染病在人群中的擴散和傳播至關(guān)重要,而嚴

2、格篩查血源及血制品中的病原體則成為最為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。
   目前針對上述病原感染的檢測手段主要依賴于免疫學和分子生物學方法。免疫學診斷的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),這種方法不能檢測出處于窗口期及新近感染病毒的血標本,造成漏檢率高。以核酸檢測技術(shù)為代表的分子生物學檢測方法雖然可縮短窗口期,但費時耗力,檢測效率較低。
   基因芯片技術(shù)具有高通量、早期診斷以及自動化的特性,能對多病原體同時進行檢測,利用該技術(shù)進

3、行大規(guī)模初篩不僅可以顯著提高采血機構(gòu)檢測效率,而且對于控制傳染性疾病的傳播提供了重要保障。然而基因芯片的臨床應用尤其是多病原的聯(lián)合檢測仍然面臨著一些問題,其中包括芯片的質(zhì)量控制以及不同核酸(DNA、RNA)樣品的標記。本研究針對這兩個問題進行了如下探索,研究內(nèi)容分為三部分。
   第一部分提出了一種新型寡核苷酸探針的設計與有效的芯片質(zhì)控方法。新型探針設計方法介紹如下:在前期實驗篩選得到的HIV探針中,本研究選取其中兩條,取其核心

4、部分50mer或60mer,在其兩端或一端分別加上一段10mer的堿基序列(相當于一個通用序列標簽,universal sequence tag,UST,與第二套通用引物部分互補的序列),設計出18條長度在60mer或70mer的寡核苷酸探針,同時將不加連接臂的該兩條探針作為實驗的陰性對照。UST可分為三種方式,分別為通用引物近5’端互補序列、中間互補序列以及近3’端互補序列。將探針打印于環(huán)氧基包被的芯片表面后,以Cy5標記的通用引物(

5、Cy5-universalprimer,Cy5-UP)與該芯片雜交,篩選出熒光信號值高于1000、信噪比(signal-to-noiseratio,SNR)高于4的探針(滿足條件之一設為陽性探針)。從芯片的雜交結(jié)果中初步篩選了五條探針(1、8、9、10、12號)。
   進一步將經(jīng)過篩選的5條探針重新打印,19號探針作為陰性對照,點樣液作為空白對照,分別以熒光標記的通用引物(Cy5-UP)與隨機引物(Cy5-randomprim

6、er,Cy5-RP,9mer),與芯片雜交,以比較兩種質(zhì)控方法的檢測效果。將通用引物與隨機引物分別倍比稀釋至20μmol/L、2μmol/L,與0.2μmol/L,與2×雜交緩沖液混合點樣。雜交洗脫經(jīng)掃描后分析其熒光信號值及SNR可知,當采用20μmol/L與2μmol/L的通用引物雜交時,通用引物雜交的熒光信號值明顯強于隨機引物;當濃度降至0.2μmol/L時,隨機引物雜交基本無熒光信號值,而通用引物雜交的8號探針仍顯示出較強信號,說

7、明了利用通用引物來檢測芯片質(zhì)量的優(yōu)越性;同時篩選出了信號強而穩(wěn)定的最佳UST為8號探針,它的連接方式是在探針的兩端各加上10mer的近5’端互補序列(UST序列為:5'-TATGACTCAG-3'),且該序列與5'端相隔兩個堿基;其次信號也較強的1號探針(UST序列與8號探針相同、只連接在靶基因探針5’端)可作為備選方案。考慮探針合成的成本與檢測效率,本研究以1號探針UST設計的方案進行后續(xù)實驗。
   為了驗證這種新型探針的穩(wěn)

8、定性,以HBV基因為研究對象,設計了13條寡核苷酸探針,將1號UST連接在了所設計的13條HBV探針的5’端。采用Cy5-UP與探針雜交,結(jié)果顯示1號UST標簽與通用引物的雜交結(jié)果信號穩(wěn)定,熒光信號值較強,可作為下一步聯(lián)合檢測寡核苷酸芯片設計及質(zhì)量控制的選擇方案。
   由此可知,本部分設計了一種新型寡核苷酸探針,并建立了一種與之匹配、有效的芯片質(zhì)控方法。
   本研究第二部分探索了通用引物聯(lián)合標記法(universal

9、 primer labeling,UPL)在DNA樣品標記中的應用。芯片雜交檢測過程中,樣品的熒光標記是極其關(guān)鍵的一個步驟,快速有效的標記技術(shù)將對基因芯片技術(shù)的應用和推廣產(chǎn)生重要的實用價值。
   限制性顯示(restriction display,RD)熒光標記技術(shù)是本實驗室核酸標記的一項專利技術(shù)。RD技術(shù)已經(jīng)被證實是一項有效的全基因組熒光標記方法,尤其適合于DNA樣品的標記。采用RD-PCR技術(shù)對樣品進行熒光標記擴增,是通過

10、對限制性酶切片段連接接頭后,以針對接頭設計的通用引物,實現(xiàn)樣品中全基因組的擴增標記。由于標記過程中涉及酶切、加接頭、一至兩輪擴增等步驟,操作較繁瑣,臨床應用時可能不易被技術(shù)人員掌握,因此,需要進一步探索新的優(yōu)化方法。
   通用引物聯(lián)合標記法UPL是本實驗室的另一項專利核酸標記技術(shù),該技術(shù)采用一種通用的隨機引物USN2(在第一套通用引物US的末端加上兩個隨機堿基),在RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后加入USN2作為引物進行10個

11、循環(huán)的第一輪PCR擴增,擴增后反應混合物中則出現(xiàn)5’端含有通用引物序列US的雙鏈DNA片段,接著采用熒光標記的通用引物(Cy3-universal sequence,Cy3-US)對這些 DNA片段進行第二輪擴增標記。由于其具有高效、簡便的優(yōu)點,UPL方法尤其適合RNA樣品的標記,在RNA病原檢測芯片中應用較多。由于聯(lián)合檢測的血液病原體中同時存在DNA病原體與RNA病原體,因此,聯(lián)合標記DNA及RNA樣品成為本研究需要解決的問題所在。本

12、部分以RD熒光標記技術(shù)作為對比,探索UPL技術(shù)在DNA樣品中的標記效率,為進一步聯(lián)合標記奠定基礎。
   首先以梅毒螺旋體的TP和POLA兩個基因片段作為研究對象,利用前期實驗篩選得到的11條探針制備芯片,對DNA片段分別進行UPL與RD標記后,與該芯片進行雜交。結(jié)果表明熒光信號值均強而穩(wěn)定,計算探針真陽性率可知二者標記效果無明顯差別。由此得出,使用UPL技術(shù)對DNA樣品進行擴增可行且高效,同時由于UPL技術(shù)中省去了酶切及加接頭

13、等步驟,操作流程更為簡單方便,為后續(xù)UPL的推廣使用奠定了堅實的基礎。
   由于采用UPL對DNA樣品進行標記后,擴增出大小在200bp~1000bp的若干DNA片段。為進一步驗證擴增片段與探針之間是否具有對應性(即優(yōu)勢擴增探針匹配的靶基因),選取TP基因的第二輪UPL擴增產(chǎn)物,進行分子克隆及轉(zhuǎn)化實驗,挑出100個克隆進行PCR鑒定,結(jié)果表明DNA片段大小與擴增標記時一致。USN2末端的堿基與Sau3AI的GATC酶切位點相同

14、,而該位點在堿基序列中的存在規(guī)律理論上是每256個堿基存在一個該位點,因此進行擴增后的DNA片段基本位于此范圍內(nèi),鑒定結(jié)果與預期相符合。由此可知,使用UPL技術(shù)對微量的DNA樣品進行擴增高效可行,且操作步驟簡單,可用于后續(xù)病原體的微量擴增。
   在建立新型探針及質(zhì)控方法、UPL聯(lián)合標記技術(shù)的基礎上,本研究第三部分制備血液病原聯(lián)合檢測芯片,并應用于小樣本的臨床樣品檢測,進一步驗證上述聯(lián)合檢測芯片技術(shù)的可靠性。
   首先

15、將第一部分設計好的13條HBV探針打印于環(huán)氧基玻片表面,使用UPL標記HBV的質(zhì)粒Bj58及血清樣品。標記后的樣品分別與芯片進行雜交,篩選出陽性探針6條,用于后續(xù)聯(lián)合檢測。其次,將UST標簽的新型探針方式用于HIV、HCV及梅毒探針的設計,其中,梅毒探針采用第二部分篩選得到的探針6條,HIV和HCV探針分別采用本實驗前期臨床實驗篩選確定的探針,各6條。將上述探針加上陽性、陰性對照打印于同一張芯片制備聯(lián)合檢測芯片。采集經(jīng)臨床確診的乙肝、丙

16、肝及梅毒血清樣品,正常人血清樣品用作陰性對照,以及模擬HIV感染的質(zhì)粒樣品。分別提取其DNA或RNA,經(jīng)UPL方法進行擴增標記后,與芯片進行雜交反應。小樣本的臨床樣品結(jié)果初步顯示,制備的聯(lián)合檢測芯片質(zhì)量可靠,UPL標記方法有效,四種病原體的基因檢測均較敏感,特異性高。
   綜上所述,本研究建立了一種新型寡核苷酸探針及有效的芯片質(zhì)控方法,探索了通用引物聯(lián)合標記法在DNA樣品標記中的應用,最終制備了血液四種病原聯(lián)合檢測的寡核苷酸芯

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論