ACER2是一個(gè)新的通過(guò)促ROS產(chǎn)生而誘發(fā)自噬與凋亡的p53靶基因.pdf

1、堿性神經(jīng)酰胺酶2（Alkaline ceramidase2，ACER2）是一個(gè)定位于高爾基體膜上的七次跨膜蛋白，在除了胎盤的各種正常組織中廣泛低表達(dá)，應(yīng)對(duì)細(xì)胞刺激如DNA損傷、血清饑餓時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)。ACER2參與鞘磷脂的代謝，能催化神經(jīng)酰胺水解生成鞘氨醇，鞘氨醇進(jìn)一步磷酸化生成1磷酸鞘氨醇。ACER2可以通過(guò)控制神經(jīng)酰胺、鞘氨醇及1磷酸鞘氨醇的相對(duì)水平進(jìn)而在細(xì)胞的增殖、衰老、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用以控制細(xì)胞的命運(yùn)。我們課題組前期的研究工

2、作已經(jīng)鑒定了ACER2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并確定了 ACER2基因的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，ACER2基因的啟動(dòng)子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。本研究在這一基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)ACER2啟動(dòng)子區(qū)域重要的順式作用元件進(jìn)行分析，并進(jìn)一步重點(diǎn)研究ACER2在細(xì)胞的自噬與凋亡中作用以及發(fā)揮功能的機(jī)制。
　　（1）ACER2啟動(dòng)子區(qū)域重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的進(jìn)一步分析
　　采用UCSC基因組瀏覽器分析A

3、CER2的基因組結(jié)構(gòu)及基因組成，根據(jù)ENCODE組蛋白修飾數(shù)據(jù)及ChromHMM染色體狀態(tài)分割數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ACER2基因是活躍轉(zhuǎn)錄的。采用MatInspector專業(yè)版與TFSEARCH軟件對(duì)ACER2的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)潛在的p53結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)潛在的p53結(jié)合位點(diǎn)序列在人、大鼠和小鼠中具有一定的保守性，提示其在ACER2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。
　　（2）p53直接調(diào)節(jié)ACER2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄

4、>　　首先，將前期構(gòu)建的各ACER2啟動(dòng)子報(bào)告基因系列刪除體、后期構(gòu)建的ACER2-P397啟動(dòng)子p53結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變重組體以及p21、Bax的報(bào)告基因分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與p53真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，結(jié)果提示，p53過(guò)表達(dá)能夠顯著提高p21、Bax的報(bào)告基因的活性以及ACER2-P397、ACER2-P676、ACER2-P800及ACER2-P1285刪除體的活性，但p53過(guò)表達(dá)對(duì)第一個(gè)p53結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變重組體的啟動(dòng)

5、子活性的上調(diào)作用受到顯著削弱甚至喪失，提示 p53主要通過(guò)ACER2啟動(dòng)子區(qū)域中的第一個(gè)潛在的p53結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮對(duì)ACER2直接轉(zhuǎn)錄激活作用。同時(shí)，將p53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，定量QRT-PCR結(jié)果顯示，p53的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性的ACER2的mRNA水平升高。采用ADR處理H1299與A549細(xì)胞，定量QRT-PCR結(jié)果顯示，DNA損傷可使p53野生型的 A549細(xì)胞內(nèi)源性的ACER2的mRNA水平升高。然后將p53

6、siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，再聯(lián)合ADR處理，定量QRT-PCR結(jié)果的顯示，siRNA介導(dǎo)的p53表達(dá)抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性的 ACER2 mRNA水平降低。另外，染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）結(jié)果也證實(shí)，p53可以在體內(nèi)結(jié)合在ACER2啟動(dòng)子核心區(qū)域的第一個(gè)潛在的p53結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果提示，p53可以直接調(diào)節(jié)ACER2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，ACER2是一個(gè)新的p53靶基因。
　　（3）ACER2誘發(fā)自噬與凋亡
　　首先，將前期構(gòu)

7、建的ACER2真核表達(dá)質(zhì)粒及p53表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)及聯(lián)合轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，wetern blot的結(jié)果分析表明，ACER2過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)LC3-II的表達(dá)，且與p53聯(lián)合共轉(zhuǎn)能誘發(fā)更強(qiáng)的LC3-II的上調(diào)；透射電鏡的分析結(jié)果表明，ACER2過(guò)表達(dá)能夠誘發(fā)自噬小體的增多，且與p53聯(lián)合共轉(zhuǎn)能誘發(fā)更多的自噬小體；免疫熒光及轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，ACER2過(guò)表達(dá)能夠誘發(fā)LC3-II斑點(diǎn)的增多，且與p53聯(lián)合共轉(zhuǎn)能誘發(fā)更多的

8、LC3-II斑點(diǎn)；流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACER2過(guò)表達(dá)后H1299細(xì)胞的凋亡數(shù)量增多，且與p53聯(lián)合共轉(zhuǎn)有助于p53誘發(fā)更多的細(xì)胞凋亡。我們將ACER2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞并聯(lián)合阿霉素（ADR）刺激，western blot與流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACER2有助于DNA損傷誘發(fā)的細(xì)胞自噬與凋亡。然后我們將ACER2 siRNA及自噬的關(guān)鍵基因ATG5 siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，再聯(lián)合ADR處理，western blo

9、t與流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡需要ACER2基因。我們采用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建ACER2蛋白N末端13、36個(gè)氨基酸殘基分別缺失的刪除體，將這兩個(gè)刪除體轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞中，western blot的結(jié)果分析表明，刪除N末端13、36個(gè)氨基酸殘基后也能誘發(fā)自噬。這些結(jié)果提示，ACER2能誘發(fā)自噬與凋亡，且有助于p53及DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡。
　?。?）ACER2通過(guò)產(chǎn)生ROS誘發(fā)自噬與凋亡
　

10、　我們采用NAC處理細(xì)胞后再將ACER2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，NAC能夠清除ACER2過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的ROS；緊接著我們采用western blot及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)自噬與凋亡，發(fā)現(xiàn)使用NAC處理后ACER2誘發(fā)的自噬與凋亡明顯減弱。然后我們將ACER2的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H1299再聯(lián)合H2O2處理，western blot及流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果分析表明，ACER2有助于H2O2誘發(fā)的自噬與凋亡。這些結(jié)果提示，AC

11、ER2通過(guò)產(chǎn)生ROS誘發(fā)自噬與凋亡。
　　綜上，我們的研究不僅發(fā)現(xiàn)ACER2啟動(dòng)子區(qū)域含有“明星基因”p53等重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，而且進(jìn)一步明確p53可以直接激活A(yù)CER2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并且可以調(diào)控內(nèi)源性ACER2的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄激活的ACER2能夠誘發(fā)自噬與凋亡，且有助于p53及DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡。DNA損傷誘發(fā)的自噬與凋亡需要ACER2基因的參與。明確了ACER2是通過(guò)鞘氨醇的積累產(chǎn)生更多ROS的機(jī)制誘發(fā)自噬與凋亡。本