ROS誘發(fā)P53介導的信號通路對小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯的影響.pdf

1、近年來，胚胎移植技術、胚胎分割技術、胚胎干細胞工程等極大地促進畜牧業(yè)的發(fā)展，而這些新技術的應用卻受到的胚胎來源的制約。胚胎在體外發(fā)育過程中，常常會發(fā)生阻滯現(xiàn)象，潛在的機制迄今還未明了。ROS是生物體內產生的超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等活性含氧化合物的總稱。課題組前期研究表明，胚胎在體外培養(yǎng)過程中，會產生ROS導致胚胎氧化應激現(xiàn)象，但其詳細的作用機理還不明確。腫瘤抑制蛋白P53作為一種細胞周期和細胞凋亡

2、的調控者，與氧化應激反應具有密切關聯(lián)，但其在胚胎中所起的作用知之甚少。所以我們假設P53在胚胎體外發(fā)育過程中在發(fā)生氧化應激時扮演重要作用，圍繞ROS與P53之間的信號通路的調控作用，深入探討ROS引起小鼠胚胎體外發(fā)育阻滯現(xiàn)象的機制。為此，本研究做了以下方面的實驗:
　　實驗一、過氧化氫誘導的胚胎氧化應激反應
　　首先探討不同濃度的過氧化氫以及不同濃度抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對胚胎發(fā)育的影響，篩選出本實驗最佳的胚胎氧

3、化應激模型為后續(xù)實驗做準備。結果表明，隨著過氧化氫濃度的增加（25μM、50μM、100μM），胚胎4細胞發(fā)育率、囊胚率顯著性降低（p＜0.05），從中優(yōu)選出50μM/L的過氧化氫為最佳應激濃度，且在添加不同濃度（1mM、5mM、25mM）的NAC實驗中，5mM時4細胞率、囊胚率顯著高于其他組(p＜0.05)，確定了5mM為最佳抗氧化濃度。觀察胚胎內部ROS水平發(fā)現(xiàn)，過氧化氫能顯著性增加胚胎內部ROS水平，添加NAC能顯著降低胚胎中RO

4、S水平。同時，本實驗結合PI染色，發(fā)現(xiàn)過氧化氫刺激的胚胎PI染色相對其他組較高。為進一步評估氧化損傷程度，對脂質過氧化產物MDA測定發(fā)現(xiàn)，過氧化氫刺激的胚胎MDA含量顯著性升高。因此，證明了一定濃度的H2O2能夠引起胚胎氧化應激，導致ROS升高、MDA表達增加的胚胎發(fā)育阻滯現(xiàn)象。
　　實驗二、ROS誘導P53信號通路對胚胎發(fā)育的影響
　　實驗主要探討應激后的胚胎ROS是如何調控P53及其相關信號通路的變化引起阻滯現(xiàn)象發(fā)生。實

5、驗結果表明，過氧化氫能夠導致P53基因表達上調，細胞周期相關基因cdc2、CDK4、CDK6下調，尤其是cdc2基因顯著性的降低(p＜0.05)，而且在蛋白水平上也發(fā)現(xiàn)H2O2能夠引起P53-ser15磷酸化蛋白表達升高以及相應的P53蛋白高表達;為了進一步探討ROS引起的相關基因變化是由P53介導發(fā)生，通過抑制劑PFT-α干擾P53表達，結果發(fā)現(xiàn)，在P53基因、P53-ser15磷酸化蛋白和P53蛋白表達顯著性抑制后，GADD45、P

6、21基因的mRNA表達水平顯著性下調，而細胞周期基因cdc2的表達顯著性高于對照組與過氧化氫組(p＜0.05)，暗示出在抑制P53表達后，相關檢驗點基因與細胞周期基因的表達與抑制前相比發(fā)生了明顯相反改變，因此ROS引起的胚胎發(fā)育阻滯現(xiàn)象可能是通過氧化應激誘導P53介導的信號通路誘發(fā)的。
　　實驗三、P53在早期胚胎中的氧化還原作用
　　本章實驗繼續(xù)從氧化酶的角度，更深入討論的P53對早期胚胎體外發(fā)育的調控。實驗首先觀察了抑制

7、P53的表達對胚胎內ROS水平的影響，其后測定了不同處理下對抗氧化酶和促氧化酶的基因mRNA、蛋白表達的影響，來觀察P53對胚胎內氧化還原系統(tǒng)的影響。結果表明，抑制P53表達會增加ROS含量，抑制抗氧化酶SOD、GPX等表達。在無應激胚胎中低水平P53可以增加抗氧化酶SOD、GPX等表達，對促氧化酶BAX、PUMA等表達無影響。在胚胎受到氧化應激時，會誘導高水平P53表達，抑制抗氧化酶SOD、GPX等表達，增加促氧化酶BAX、PUMA等

8、表達。
　　綜上所述:本實驗結果表明ROS可以誘導體外發(fā)育的早期胚胎發(fā)生氧化應激現(xiàn)象，導致胚胎內脂質過氧化、胚胎發(fā)育受阻等現(xiàn)象的發(fā)生。ROS導致胚胎應激，可以誘導P53的高表達，從而刺激其下游控制檢驗點基因GADD45a、P21的表達來降低細胞周期進程相關基因cdc2、CDK4的表達，導致細胞發(fā)生阻滯現(xiàn)象。為了驗證這種關系，對P53進行了抑制實驗，充分證明了以上結果。此外，在對抗氧化酶與促氧化酶的研究中發(fā)現(xiàn)，P53可以根據(jù)其表達水