對(duì)骨骼、牙齒DNA提取方法的深入研究.pdf

1、目的:
　　本課題旨在對(duì)法醫(yī)檢案中骨骼和牙齒這兩種特殊檢材進(jìn)行DNA檢測(cè)，通過(guò)對(duì)不同脫鈣劑、消化液的深入研究，采用SPSS軟件分析比較不同提取方法的骨骼DNA濃度值，尋找最合適的脫鈣劑和消化液，建立一套程序相對(duì)簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、清晰可靠，DNA提取效率高的提取方法。
　　方法:
　　1、用不同的酸類脫鈣液（自制10％鹽酸脫鈣液、10%硝酸脫鈣液、硝酸和甲酸混合脫鈣液、甲酸脫鈣液、HAS改良脫鈣液）對(duì)骨粉采用常規(guī)方法（脫鈣

2、，消化、純化、擴(kuò)增、3130XL遺傳分析儀等的一系列過(guò)程）進(jìn)行DNA分型圖譜分析；
　　2、用不同濃度的EDTA脫鈣液（0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L）對(duì)骨粉進(jìn)行脫鈣，每組脫鈣時(shí)間嚴(yán)格按編號(hào)從小到大采用3h、6h、12h、24h分別進(jìn)行。各組脫鈣完畢后均采用同種方法消化、純化、DNA濃度測(cè)定、擴(kuò)增、3130XL遺傳分析儀進(jìn)行DNA分型圖譜分析，尋求最合適的EDTA脫鈣液濃度和作用時(shí)間；
　　3、用三種不同

3、種類的消化液（ CTAB、Bone incubation buffer、QIAamp DNA Investigator）對(duì)骨粉進(jìn)行消化，純化、DNA濃度測(cè)定及SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析、擴(kuò)增、3130XL遺傳分析儀進(jìn)行DNA圖譜分析，找到最合適的消化液；
　　4、用三種不同的消化液（CTAB、Bone incubation buffer、QIAamp DNA Investigator）對(duì)牙齒消化，純化、擴(kuò)增、3130XL遺傳分析儀進(jìn)行D

4、NA圖譜分析，目的是為了證明同樣的硬組織采用上述方法進(jìn)行提取，同時(shí)對(duì)上述方法予以驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)嚴(yán)格配制的酸性溶液雖然對(duì)組織及細(xì)胞均有很強(qiáng)的脫鈣作用，但是也對(duì)DNA具有很強(qiáng)破壞作用，因此得到的DNA量也相對(duì)很少甚至破壞徹底，根本得不到完整的DNA分型。
　　2、在3h-24h時(shí)間段內(nèi)，骨骼DNA經(jīng)三種不同濃度的EDTA脫鈣液脫鈣后濃度值呈現(xiàn)的趨勢(shì)不同，0.25mol/L實(shí)驗(yàn)組呈大致增高趨勢(shì)，且在12-2

5、4h濃度均值達(dá)到頂峰，16個(gè)STR基因座全部檢出率為62.5%；0.5mol/L實(shí)驗(yàn)組呈先升高再降低的趨勢(shì)，在6-12h濃度均值最高，16個(gè)STR基因座全部檢出率為90%；1mol/L實(shí)驗(yàn)組呈降低趨勢(shì)，在3-6h濃度均值最高，16個(gè)STR基因座全部檢出率為67.5%。而當(dāng)比較脫鈣時(shí)間一致而EDTA脫鈣液濃度不同時(shí)，0.5mol/L實(shí)驗(yàn)組在不同的時(shí)間段上所得到的DNA濃度值仍然均高于其他兩組。
　　3、一克骨粉經(jīng)不同消化方法（Bon

6、e incubation buffer法、DNA Investigator Kit法和 CTAB法）得到的 DNA量分別為26.53±5.47ng/μL、23.63±4.56ng/μL、14.93±3.88ng/μL，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)中單因素方差分析表明三組數(shù)據(jù)之間的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果顯示Bone incubation buffer法和DNA Investigator Kit法基因座檢出率和RFU值大致相同，均優(yōu)

7、于CTAB法。
　　4、采用與骨骼一致的CTAB、Bone incubation buffer、DNA Investigator kit三種提取方法對(duì)牙齒進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，同樣印證了上述實(shí)驗(yàn)方法得到結(jié)果的準(zhǔn)確性，即CTAB法得到的DNA量較少，峰值較低，個(gè)別分型有缺如位點(diǎn)，與其他兩種方法差異明顯。
　　結(jié)論:
　　1、在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用鹽酸、硝酸、甲酸、水楊酸、乙酸等酸脫鈣劑對(duì)骨組織脫鈣后進(jìn)行病理涂片等效果明顯，但用其對(duì)骨

8、骼樣本脫鈣后進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，未得到理想分型結(jié)果，表明此類脫鈣劑目前已不適合法醫(yī)物證領(lǐng)域骨骼、牙齒DNA的提取。
　　2、在3-24小時(shí)時(shí)間段內(nèi)，骨骼樣本經(jīng)三種不同濃度的EDTA脫鈣液脫鈣后DNA濃度值形成不同的趨勢(shì)，0.25mol/L EDTA脫鈣液組呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，0.5mol/L EDTA脫鈣液組呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)，1mol/L EDTA脫鈣液組呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中0.5mol/L EDTA脫鈣液作用6-12小時(shí)DN

9、A濃度值可形成最高峰，說(shuō)明選擇濃度適中的脫鈣液至關(guān)重要，濃度太低或太高都對(duì)DNA的提取不利，因此在檢案中把脫鈣時(shí)間控制在6-12小時(shí)之間為最佳。
　　3、采用CTAB、Bone incubation buffer、DNA Investigator kit三種提取方法得到的骨骼DNA濃度經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明三種方法之間的差異性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTAB法得到的DNA量較少，與其他兩種方法差異甚是明顯，其他兩組盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)意