水稻白葉枯菌MLVA基因分型方法的建立.pdf

1、水稻白葉枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)是水稻種植區(qū)的世界性病害，尤其以亞洲稻區(qū)發(fā)生最重，是我國為水稻的三大病害之一。研究病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)將有助于籌劃育種策略以及合理的安排抗性品種的種植布局，從而使該病害的發(fā)生控制在適度的水平。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)可以較好的從基因水平揭示種群間個(gè)體的差異，這方面的研究報(bào)道很多。目前，用于對Xoo基因分型的分子標(biāo)記技術(shù)主要有限制性片段長度多態(tài)性(Restricti

2、on Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random Amplified Ploymorphic DNA,RAPD)、插入序列PCR法(IS-PCR)、重復(fù)序列PCR法(Rep-PCR)等，但這些方法均存在一些不足，如分辨率低、重復(fù)性差、技術(shù)要求高等。近年來隨著許多物種的全基因組序列測序工作的完成，以此為基礎(chǔ)的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multiple-Locus Variable

3、-numbertandem-repeat Analysis，MLVA)逐漸被廣泛應(yīng)用于各物種的基因分型研究中。本研究應(yīng)用MLVA基因分型方法取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.本研究采用Tandem Repeats Finder software(TRF)軟件在2-7-7-50策略下對三株測序菌株P(guān)XO99A、KACC10331、MAFF311018的全基因組序列進(jìn)行分析，分別得到了421、389、393個(gè)可變串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)(Va

4、riable Number of TandemRepeat，VNTR)。通過人工篩選比對這些位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了只有重復(fù)單元TR1在該三株菌株中的重復(fù)數(shù)分別為9.6、20.6、13.6，表現(xiàn)出了重復(fù)次數(shù)的多態(tài)性。對人工篩選出的VNTR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，通過現(xiàn)實(shí)模板菌株的PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析，最終確立7個(gè)VNTR位點(diǎn)用以構(gòu)建水稻白葉枯菌的MLVA基因分型體系。
　　 2.應(yīng)用構(gòu)建的該MLVA基因分型體系對湖北7地區(qū)的158株白葉

5、枯菌進(jìn)行MLVA分型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，TR1位點(diǎn)的多態(tài)性較好(h＞0.58)，其他6個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性呈中等程度(0.10≤h≤0.58)。MLVA分型體系將湖北7地區(qū)的158株白葉枯菌株分為31個(gè)基因型，在70％相似水平上，可分為10簇，其中A簇共96株，占菌株總數(shù)的60.76%，說明該簇為湖北稻區(qū)白葉枯菌的主要簇群，其他各簇所占菌株總數(shù)比例較低。各地區(qū)菌株在簇群的分布上，宜昌地區(qū)的菌株構(gòu)成最為復(fù)雜，在8個(gè)簇群均有分布，而某些地區(qū)的菌株有一定

6、的地理特屬性，如F簇只有來自宜昌的兩個(gè)菌株YC5、YC6。用MLVA分型結(jié)果和rep-PCR的ERIC引物分型結(jié)果進(jìn)行比較，ERIC引物可將湖北稻區(qū)的白葉枯菌株分為26種譜型，表明MLVA分型在分辨能力上優(yōu)于ERIC引物，而在成簇表現(xiàn)上，ERIC引物在70%相似水平上可成11簇，且有兩個(gè)主力簇群，成簇上ERIC更佳。
　　 綜上所述，本研究構(gòu)建的MLVA基因分型體系具有較好的分型能力，尋求更多具有多態(tài)性的VNTR的位點(diǎn)，以優(yōu)化V