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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
建立適合中國(guó)萊姆病螺旋體(又稱伯氏疏螺旋體)的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multi-locusvariablenumbertandemrepeatanalysis,MLVA)基因分型方法,對(duì)來(lái)自中國(guó)12個(gè)省45個(gè)地區(qū)的95株伯氏疏螺旋體進(jìn)行MLVA分型鑒定和聚類分析,探討中國(guó)伯氏疏螺旋體菌群特征,并為萊姆病的分子流行病學(xué)調(diào)查,疫情溯源及菌群進(jìn)化分析提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
方法:
1.MLVA
2、是一種以可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variablenumbertandemrepeat,VNTR)為基本單位的,根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)VNTR在不同菌株中的多態(tài)性即拷貝數(shù)的差異,形成VNTR分辨率,通過(guò)VNTR分辨率的可疊加性以獲得對(duì)菌株的最佳分辨效果的基因分型方法。
2.使用TandemRepeatsFinder基因掃描軟件掃描中國(guó)優(yōu)勢(shì)菌種Borreliagarinii的國(guó)際參考菌株P(guān)Bi的904.246kb染色體基因和質(zhì)粒(CP26和L
3、P54)基因,分析基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn),篩選多個(gè)潛在的VNTR位點(diǎn)。
3.利用PCR(PolymeraseChainReaction)技術(shù)檢驗(yàn)潛在VNTR位點(diǎn)的普遍擴(kuò)增性和特異性差異的分辨能力。
4.通過(guò)STR(ShortTandemRepeat)測(cè)序收集VNTR信息并建立菌株VNTR譜。
5.聚類分析,用BioNumerics5.1軟件處理數(shù)據(jù),用Categorical系數(shù)和UPGMA(UnweightedPai
4、r-GroupMethodwithArithmetic,非加權(quán)算術(shù)平均法)進(jìn)行聚類分析,初步建立萊姆病螺旋體的MLVA分型方法,進(jìn)而對(duì)95株中國(guó)菌株和6株國(guó)際參考株進(jìn)行MLVA分型研究,并與多位點(diǎn)序列分析(multi-locussequenceanalysis,MLSA)的基因分型結(jié)果進(jìn)行比較。
結(jié)果:
1.篩選出5個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行組合,建立萊姆病螺旋體的MLVA方法。將101株萊姆病螺旋體分為51個(gè)獨(dú)立的基因型,
5、4個(gè)明顯的基因簇,即Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliavalaisiana。分型結(jié)果與MLSA基因分型結(jié)果一致。
2.全部5個(gè)VNTR位點(diǎn)(VNTR-1,VNTR-2,VNTR-3,VNTR-4,和VNTR-5)對(duì)應(yīng)的等位基因種類數(shù)分別為7,3,9,7和6;相應(yīng)的位點(diǎn)多態(tài)性指數(shù)為0.79,0.22,0.77,0.71和
6、0.67;5個(gè)VNTR位點(diǎn)分辨率疊加,多態(tài)性指數(shù)達(dá)0.96。
結(jié)論:
1.建立了一種適合中國(guó)萊姆病螺旋體菌株的MLVA基因分型的方法。MLVA分型方法操作簡(jiǎn)單,分型穩(wěn)定,重復(fù)性好,分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
2.聚類分型結(jié)果表明中國(guó)萊姆病螺旋體表現(xiàn)出廣泛的遺傳異質(zhì)性,存在Borreliaburgdorferisensustricto,Borreliagarinii,Borreliaafzelii,Borreliav
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