cDNA-AFLP分析與白葉枯病菌互作中水稻基因的表達(dá)圖譜.pdf

1、本文以日本晴水稻(Nipponbare)成熟種子誘導(dǎo)獲得的愈傷組織，轉(zhuǎn)至MS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得水稻懸浮培養(yǎng)系。用親合的白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)JxoI接種水稻懸浮細(xì)胞進(jìn)行互作，互作不同時(shí)間的水稻細(xì)胞，用液氮冷凍，研磨后熱酚抽提，氯化鋰沉淀提取總RNA，并進(jìn)一步使用鏈霉素結(jié)合的oligo(dT)-磁珠法分離純化mRNA，純化的mRNA以oligo(dT)21引物反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，繼而合成c

2、DNA第二鏈。 得到的雙鏈全長(zhǎng)cDNA先后用限制性內(nèi)切酶VspI(識(shí)別4個(gè)堿基位點(diǎn))和TaqI(識(shí)別6個(gè)堿基位點(diǎn))酶切，酶切后的cDNA片段帶有兩種粘性末端，分別連接上與之對(duì)應(yīng)的兩種接頭，得到代表水稻細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜且?guī)в薪宇^的cDNA片段池(pool)。使用與接頭序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物(oligo63/oligo43)對(duì)cDNA片段池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使cDNA片段池中不同豐度的基因片段都達(dá)到一定的濃度。對(duì)擴(kuò)增后的cDNA池定量至1

3、ng/ul，作選擇性擴(kuò)增的模板。共使用64對(duì)引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。其中與TaqI粘末端相對(duì)應(yīng)的選擇性引物用[γ-32p]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在含有7.5M尿素的5％的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳后的凝膠用X光片顯示出不同處理水稻細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄圖譜。根據(jù)X光片所顯示信息，對(duì)凝膠上差異擴(kuò)增片段進(jìn)行回收。64對(duì)選擇性引物擴(kuò)增中共得到384個(gè)有差異的擴(kuò)增片段，其中321個(gè)受白葉枯病菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，余下的63個(gè)下調(diào)表達(dá)。

4、 差異表達(dá)的基因片段回收后，對(duì)其中的100個(gè)片段作測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果在GenBank里在線分析，其中23個(gè)功能已知或有可能功能，41個(gè)功能未知。 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，選擇6個(gè)差異表達(dá)的基因用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timequantitativePCR)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果與cDNA-AFLP中所顯示這6個(gè)基因表達(dá)變化情況相符合，表明cDNA-AFLP中回收的DNA差異表達(dá)片段的確代表水稻細(xì)胞與白葉枯病菌互作后差異表達(dá)的基因。