慢性炎癥刺激對小鼠主動脈內(nèi)皮脂肪酶表達影響的研究.pdf

1、目的：
　　心腦血管疾病已成為威脅人類健康的頭號殺手，動脈粥樣硬化則是其重要的致病因素之一。目前認為，動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要原因是脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應，雖然它們各自都是動脈粥樣硬化獨立的危險因素，但越來越多的研究表明，二者在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中是相互影響和相互促進的。
　　內(nèi)皮脂肪酶是近年來新發(fā)現(xiàn)的甘油三酯脂酶家族的成員，在脂代謝過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)皮脂肪酶主要具有磷脂酶活性，是高密度脂蛋白代謝的關鍵酶，

2、其主要由內(nèi)皮細胞分泌產(chǎn)生，肝細胞和平滑肌細胞等也可有少量分泌。高密度脂蛋白是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的保護性因素，因而抑制EL的活性或減少EL的表達，可能在一定程度上抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。EL的表達調(diào)控受多種因素影響，炎癥、血壓及血管剪切力等都可影響EL的表達;此外，ANGPTL3是由肝臟分泌產(chǎn)生的一種細胞因子，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。相關研究表明其可能是內(nèi)源性的EL抑制劑。由于炎癥是動脈粥樣硬化重要的致病因素之一。因此，進一

3、步明確炎癥調(diào)控內(nèi)皮脂肪酶在體內(nèi)表達的機制，則可能為我們在脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應之間構建一個新的橋梁，進而為動脈粥樣硬化的研究和干預提供新的思路。
　　脂多糖(LPS)是重要的炎癥反應的刺激物，它可以選擇性的作用于細胞表面的Toll樣受體4(TLR-4)，從而激活細胞內(nèi)的炎癥反應信號通路，例如NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路等，研究已表明LPS可促進動物及人類的動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路都是炎

4、癥反應時細胞內(nèi)重要的信號傳導系統(tǒng)。研究表明，其可能是各種危險因素導致動脈粥樣硬化的機制之一。PDTC是一種金屬離子螯合劑，其可以競爭性抑制IκBα的釋放，進而抑制NF-κB信號傳導通路的激活。SB203580可以選擇性的抑制p38MAPK的激活，而對于JNK/SAPK和p44/42MAPK(即Erk1/2)無顯著作用。本課題以野生型C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠為研究對象，通過腹腔注射脂多糖作為慢性炎癥刺激，觀察在體內(nèi)炎癥環(huán)境下

5、脂多糖對小鼠主動脈內(nèi)皮脂肪酶(EL)、NF-κB p65、p38MAPK及磷酸化的p38MAPK的表達影響，同時觀察他汀類藥物（阿托伐他汀鈣）對該效應的抑制作用。此外通過腹腔注射NF-κB信號通路阻斷劑PDTC和p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580進一步驗證脂多糖是否通過NF-κB和p38MAPK信號傳導途徑調(diào)節(jié)小鼠主動脈內(nèi)EL的表達。
　　方法：
　　2.1動物模型的建立
　　選取8周齡野生型雄性C57BL/

6、6小鼠共40只，8周齡雄性ApoE-/-小鼠共8只，適應性普食喂養(yǎng)一周后，改為高脂飲食（15％黃油，0.25％膽固醇）喂養(yǎng)。
　　實驗分組共分為六組，每組8只，包括:①LPS(C57BL/6)組:腹腔注射LPS(2mg/kg)，每周三次，持續(xù)12周;②LPS(ApoE-/-)組:同樣給予腹腔注射LPS(2mg/kg)，每周三次，持續(xù)12周;③阿托伐他汀鈣組:腹腔注射LPS(2mg/kg)，同時給予阿托伐他汀鈣懸液灌胃(20mg/k

7、g/d)，持續(xù)12周;④正常對照組:腹腔注射生理鹽水(2mg/kg)，每周三次，持續(xù)12周;⑤PDTC組:腹腔注射LPS(2mg/kg)，同時給予PDTC(20mg/kg/d)腹腔注射，持續(xù)12周;⑥SB203580組:腹腔注射LPS(2mg/kg)，同時給予SB203580(5ug/kg/d)腹腔注射，持續(xù)12周。在藥物干預的12周末，對各組小鼠進行安樂死。
　　2.2血脂測定
　　前4組(LPS(C57BL/6)組，LP

8、S(ApoE-/-)組，阿托伐他汀鈣組，正常對照組）小鼠處死前，空腹經(jīng)心臟采血，收集血清，檢測甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。
　　2.3血清TNF-α、IL-1β和ANGPTL3測定
　　通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，用試劑盒對采集的前4組小鼠（同上）的血清進行TNF-α、IL-1β和ANGPTL3的含量測定。
　　2.4HE染色和免疫組化

9、
　　ApoE-/-組小鼠和正常對照組小鼠在藥物干預12周后取材。取主動脈弓部至降主動脈長約1-1.5cm的組織，脫水后石蠟包埋，5um切片行HE染色。應用免疫組化方法檢測ApoE-/-小鼠和正常對照組小鼠主動脈內(nèi)EL的表達，Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件計算陽性面積占動脈粥樣硬化斑塊面積百分比。
　　2.5Western Blot
　　取前4組小鼠（同上）主動脈弓部至降主動脈長約1-1.5cm的組織，

10、用加入了磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解組織提取總蛋白，然后用BCA法測定蛋白濃度。電泳轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗、發(fā)光，測量主動脈內(nèi)EL、NF-κB p65、p38MAPK以及p-p38MAPK的相對含量。
　　2.6統(tǒng)計學分析
　　實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(MEAN±SD)表示，兩兩比較采用非配對t檢驗，多個實驗組之間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)。統(tǒng)計學分析采用GraphPrism5統(tǒng)計軟件。P＜0.05,差異有統(tǒng)

11、計學差異。
　　結果：
　　3.1LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中總膽固醇表達水平較正常對照組明顯升高，p＜0.05; LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表達水平較正常對照組明顯降低，p＜0.05。阿托伐他汀鈣組小鼠血清總膽固醇表達水平較LPS(C57BL/6)組明顯降低，而血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表達水平，較LPS(C

12、57BL/6)組小鼠明顯增加，均p＜0.05。
　　3.2LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中TNF-α和IL-1β表達量較正常對照組均明顯增加，均p＜0.05。阿托伐他汀鈣組小鼠血清TNF-α和IL-1β表達量則較LPS(C57BL/6)組小鼠明顯降低，均p＜0.05。
　　3.3LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠血清中ANGPTL3的表達量較正常對照組明顯降低，均p＜0

13、.05。阿托伐他汀鈣組小鼠血清ANGPTL3表達量則較LPS(C57BL/6)組小鼠明顯增加，p＜0.05。
　　3.4LPS(C57BL/6)組和LPS(ApoE-/-)組小鼠EL的表達量較正常對照組明顯增加，均p＜0.05。阿托伐他汀鈣組主動脈EL的表達量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少，p＜0.05。
　　3.5LPS(C57BL/6)組小鼠和LPS（ApoE-/-）組小鼠主動脈內(nèi)NF-κ B p6

14、5和p-p38MAPK蛋白表達量較正常對照組明顯增加，均p＜0.05;阿托伐他汀鈣組小鼠主動脈內(nèi)p-p38MAPK蛋白表達量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少，均p＜0.05,而NF-κB p65蛋白表達量變化則不顯著。
　　3.6野生型C57BL/6小鼠在腹腔注射LPS的同時，腹腔注射PDTC，主動脈EL的表達量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少，p＜0.05。
　　3.7野生型C57B

15、L/6小鼠在腹腔注射LPS的同時，腹腔注射SB203580，主動脈EL的表達量與單純接受LPS刺激的C57BL/6小鼠相比明顯減少，p＜0.05。
　　3.8H&E染色結果顯示正常對照組小鼠主動脈弓部內(nèi)膜光滑，無明顯增厚，內(nèi)皮細胞排列整齊。ApoE-/-小鼠主動脈弓部內(nèi)膜和中膜則有明顯的動脈粥樣硬化表現(xiàn)，可見多發(fā)的動脈粥樣硬化斑塊形成。免疫組化結果顯示，正常對照組小鼠主動脈內(nèi)幾乎沒有EL的表達，而ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜，尤其

16、是斑塊內(nèi)，則可見明顯的EL的表達。
　　結論：
　　1.LPS可以增加炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達，并可能通過這種慢性炎癥反應促進野生型C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)皮脂肪酶的表達。
　　2.LPS可能通過抑制ANGPTL3的表達促進小鼠主動脈內(nèi)皮脂肪酶的表達。
　　3.LPS促進小鼠主動脈內(nèi)皮脂肪酶表達的效應可能部分通過激活NF-κB和p38MAPK信號傳導途徑實現(xiàn)。
　　4.阿托