Egr-1在移植靜脈再狹窄中的作用和內(nèi)皮脂肪酶在動脈粥樣硬化中的表達(dá)研究.pdf

1、第一部分 Egr-1在移植靜脈再狹窄中的作用研究
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種常見病、多發(fā)病，極易造成心、腦、腎、肢體等器官缺血，目前臨床除降血脂外大多采取搭橋及血管成形術(shù)予以治療。然而移植靜脈再狹窄(Restenosis，Rs)是影響手術(shù)遠(yuǎn)期效果的最主要并發(fā)癥。由于受到動脈化的血流動力學(xué)改變移植靜脈發(fā)生血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmooth muscle cell，VSMC)增殖、新內(nèi)

2、膜增生，并最終發(fā)生堵塞。目前其確切的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，但近年來機(jī)械張力增加與移植靜脈血管重構(gòu)的相關(guān)研究越來越受到人們的關(guān)注。
　　 Affymetrix gene array結(jié)果顯示早期生長反應(yīng)基因-1(Early growth responsegene1,Egr-1)是機(jī)械張力敏感性核轉(zhuǎn)錄因子。本課題旨在前期研究的基礎(chǔ)上，從體內(nèi)動靜脈移植手術(shù)模型、體外機(jī)械張力刺激血管平滑肌細(xì)胞模型，探索Egr-1在移植靜脈新內(nèi)膜增生中的作

3、用及可能的機(jī)制，為進(jìn)一步闡明移植靜脈再狹窄的分子機(jī)制提供依據(jù)。
　　 一 Egr-1在靜脈移植后新內(nèi)膜增生中的作用
　　 目的：
　　 移植靜脈再狹窄是以血管平滑肌細(xì)胞增殖為主的新內(nèi)膜增生為主要病理特征。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠下腔靜脈-頸總動脈移植手術(shù)模型觀察移植靜脈新內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)的病理改變。為進(jìn)一步探討Egr-1在移植靜脈再狹窄中的作用，采用Egr-1基因敲除小鼠行靜脈移植手術(shù)，觀察Egr-1缺失對移植靜脈新

4、內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)病變的影響。
　　 方法：
　　 建立同基因小鼠下腔靜脈-頸動脈移植手術(shù)模型(vein graf，VG)。健康C57BL/6J小鼠和Egr-1基因敲除小鼠各36只，體重22-26g，28只造模，即野生型小鼠模型組(WT/VG)和Egr-1基因敲除小鼠模型組(Egr-1 KO/VG)；余下8做對照，即野生型對照組(WT)和Egr-1基因敲除小鼠對照組(Egr-1 KO)。術(shù)后24小時(shí)打開頸部皮膚，血流暢通

5、者為模型組，繼續(xù)飼養(yǎng)四周，血管顏色泛黑為手術(shù)失敗。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，麻醉小鼠，分離移植靜脈；取部分標(biāo)本行HE染色觀察血管重構(gòu)病變，并行免疫組化染色檢測smooth muscleα actin(SMA)和IGF-IR的表達(dá)；其余標(biāo)本凍于-80℃冰箱用作RNA檢測；采用Real time PCR檢測移植靜脈Egr-1和IGF-1R mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、小鼠行靜脈移植手術(shù)4周后，切片HE染色

6、顯示野生型小鼠模型組移植靜脈壁明顯增厚，血管口徑縮窄；SMA免疫組化染色顯示血管平滑肌細(xì)胞明顯增生。這說明血管移植手術(shù)4周后移植靜脈發(fā)生了明顯的血管重構(gòu)、新內(nèi)膜增生。
　　 2、免疫組化染色和Real time PCR檢測到Egr-1和IGF-1R在移植靜脈中表達(dá)增加。
　　 3、HE染色和SMA染色顯示，與野生型小鼠模型組相比Egr-1基因敲除小鼠血管移植后的靜脈新內(nèi)膜增生及血管平滑肌細(xì)胞增殖明顯減弱。
　　

7、4、免疫組化染色和Real time PCR顯示，與野生型小鼠模型組相比Egr-1基因敲除小鼠移植靜脈中IGF-1R的表達(dá)下降(53±6.8％ of WTNG，n=4，P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制小鼠靜脈移植手術(shù)模型，觀察到移植靜脈血管重構(gòu)伴明顯的新內(nèi)膜增生。
　　 2、移植靜脈中Egr-1和IGF-1R表達(dá)明顯增加。
　　 3、我們從整體水平證實(shí)Egr-1缺失明顯逆轉(zhuǎn)移植靜脈

8、的新內(nèi)膜增生，并且Egr-1缺失后抑制IGF-1R表達(dá)增加。提示Egr-1可能通過調(diào)控下游生長因子信號通路參與血管移植后靜脈重構(gòu)的過程。
　　 二 Egr-1在機(jī)械張力引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用
　　 目的：
　　 Egr-1是機(jī)械張力敏感的核轉(zhuǎn)錄因子，然而其在機(jī)械張力引起的的血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用尚不十分清楚。為進(jìn)一步探討Egr-1參與移植靜脈新內(nèi)膜增生的機(jī)制，本研究通過建立體外機(jī)械張力誘導(dǎo)血管平滑肌

9、細(xì)胞增殖模型，觀察機(jī)械張力對Egr-1表達(dá)變化的影響，并研究Egr-1缺失對機(jī)械張力刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 體外分離野生型小鼠和Egr-1基因敲除小鼠血管平滑肌細(xì)胞，運(yùn)用FX-4000T細(xì)胞柔性基底應(yīng)交加載系統(tǒng)，給細(xì)胞施以周期性張力牽伸，以模擬體內(nèi)循環(huán)機(jī)械張力。分為野生型VSMC對照組(WT)；野生型VSMC+機(jī)械張力刺激組(WT/ST): Egr-1缺失VSMC對照組(Egr-

10、1 KO)；Egr-1缺失VSMC+機(jī)械張力刺激組(Egr-1 KO/ST)。采用Real time PCR和Western blot方法測定細(xì)胞內(nèi)Egr-1和IGF-1R的mRNA和蛋白表達(dá)變化。采用BrdU染色觀察血管平滑肌細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、機(jī)械張力處理血管平滑肌細(xì)胞30到60min即明顯誘導(dǎo)Egr-1表達(dá)。
　　 2、機(jī)械張力處理血管平滑肌細(xì)胞18h后，WT/ST組BrdU陽性細(xì)胞比率

11、比WT組增加8.3倍，而Egr-1缺失后Egr-1KO/ST組BrdU陽性細(xì)胞比率降低(52.6±8.6％ of WT/ST，n=4，P<0.01)。
　　 3、機(jī)械張力處理血管平滑肌細(xì)胞24h后，Egr-1KO/ST組IGF-1R蛋白表達(dá)下降(48±7％ of WT/ST，n=5，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、體外成功復(fù)制了機(jī)械張力刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖模型。
　　 2、機(jī)械張力刺激快速誘導(dǎo)

12、血管平滑肌細(xì)胞Egr-1表達(dá)。
　　 3、Egr-1缺失明顯逆轉(zhuǎn)機(jī)械張力刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖和IGF-1R表達(dá)上調(diào)。
　　 三 Egr-1對機(jī)械張力激活I(lǐng)GF-1R轉(zhuǎn)錄的作用及分子機(jī)制
　　 目的：
　　 我們已經(jīng)證實(shí)Egr-1在機(jī)械張力增加引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖和移植靜脈新內(nèi)膜增生中起重要作用。然而Egr-1是否通過影響IGF-1R轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用尚不清楚。IGF-1R啟動子區(qū)有多個(gè)Egr-1可能

13、的結(jié)合位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔剿鱁gr-1對IGF-1R轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響及機(jī)制，從而揭示Egr-1參與機(jī)械張力刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖及移植靜脈再狹窄過程可能的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、采用IGF-1R啟動子缺失突變及l(fā)inker-scan突變質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性分析，尋找對機(jī)械張力刺激敏感的IGF-1R啟動子轉(zhuǎn)錄激活元件所在區(qū)域。
　　 2、凝膠電泳遷移率變動分析(EMSA)觀察機(jī)械張力刺激

14、后核蛋白與IGF-1R啟動子區(qū)的結(jié)合。
　　 3、采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)觀察機(jī)械張力刺激誘導(dǎo)Egr-1與IGF-1R啟動子區(qū)核心序列的結(jié)合。
　　 結(jié)果：
　　 1、機(jī)械張力刺激誘導(dǎo)IGF-1R啟動子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)；IGF-1R啟動子缺失突變分析顯示(-270/-130)區(qū)是應(yīng)答機(jī)械張力刺激的核心區(qū)域。
　　 2、突變IGF-R啟動子-170/-150或者-210/-190區(qū)使機(jī)械張力刺激IGF-1

15、R啟動子轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)消失；在這兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域分別有Egr-1的結(jié)合序列：(GCGGGGGCG，-196/-188)和(GCGGGCGCG，-162/-154)。
　　 3、機(jī)械張力刺激血管平滑肌細(xì)胞30-60min后，核蛋白與IGF-1R啟動子結(jié)合增加。
　　 4、ChIP assay結(jié)果顯示，機(jī)械張力刺激血管平滑肌細(xì)胞Egr-1與IGF-1R啟動子特異性結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 我們從體外分子水平證實(shí)，

16、IGF-1R啟動子(-170/-150)和(-210/-190)含有對機(jī)械張力刺激敏感的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)元件；機(jī)械張力刺激Egr-1特異性地結(jié)合到IGF-1R啟動子核心序列區(qū)并激活其轉(zhuǎn)錄。
　　 研究小結(jié)
　　 本部分借助Egr-1基因敲除小鼠通過體內(nèi)動靜脈移植手術(shù)模型、體外機(jī)械張力刺激血管平滑肌細(xì)胞模型探討了Egr-1在移植靜脈再狹窄中的作用。并從體外證實(shí)機(jī)械張力刺激下Egr-1通過結(jié)合IGF-1R啟動子核心序列激活其轉(zhuǎn)錄

17、。這從分子水平證實(shí)Egr-1可能通過調(diào)控IGF-1R轉(zhuǎn)錄參與機(jī)械張力引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖及移植靜脈再狹窄的過程。
　　 第二部分內(nèi)皮脂肪酶在動脈粥樣硬化中的表達(dá)研究
　　 目的：
　　 內(nèi)皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)被證明是HDL代謝的關(guān)鍵酶，可能通過降解HDL參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步明確其在動脈粥樣硬化中的表達(dá)調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)借助大鼠高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化模型和體外LPS

18、刺激Raw264.7細(xì)胞模型探討EL的表達(dá)變化及可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 建立高脂飲食誘導(dǎo)大鼠動脈粥樣硬化模型。健康SD大鼠24只，體重200-220g，14只高脂飼料喂養(yǎng)，余下10正常飼料喂養(yǎng)做對照(CTL組)。12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，抽血留做血脂檢測。處死大鼠，分離主動脈弓至腹主動脈分叉處；取部分標(biāo)本行HE染色和EL免疫組化染色；其余標(biāo)本凍于-80℃冰箱用作蛋白和RNA檢測；體外LPS刺激Raw264.7細(xì)胞檢測E